沙門菌基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時間質(zhì)譜方法研究

趙劍虹，高 艷，李書明，張士堯，王恒偉，顧 琳，韓慶華，焦 洋，陳 倩

沙門菌基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時間質(zhì)譜方法研究

趙劍虹1，高 艷1，李書明1，張士堯1，王恒偉1，顧 琳1，韓慶華1，焦 洋1，陳 倩2

目的優(yōu)化基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時間質(zhì)譜(MALDI-TOF-MS)法對沙門菌鑒定的條件，研究不同前處理方法對MALDI靶板污染情況，建立安全高效的檢測沙門菌的方法。方法應(yīng)用MALDI-TOF-MS 法對4株沙門菌標(biāo)準(zhǔn)菌株進(jìn)行不同培養(yǎng)條件、樣品前處理方式檢驗,確立優(yōu)化的鑒定程序，對不同處理方式下MALDI靶板進(jìn)行檢測，采用優(yōu)化的前處理方法對33株腹瀉病人糞便標(biāo)本中分離的沙門菌進(jìn)行數(shù)據(jù)采集和圖譜比對，所得鑒定結(jié)果與常規(guī)血清學(xué)分型結(jié)果比較。結(jié)果不同前處理方法、不同的培養(yǎng)基上沙門菌標(biāo)準(zhǔn)菌株均準(zhǔn)確鑒定為沙門菌。 33株沙門菌用MALDI-TOF-MS方法全部準(zhǔn)確鑒定為沙門菌屬,19株沙門菌在種的鑒定水平上與血清分型結(jié)果完全一致，14株沙門菌在種的鑒定水平上與血清分型結(jié)果不一致。不同前處理方法的MALDI靶板上均未發(fā)現(xiàn)細(xì)菌生長。結(jié)論MALDI-TOF-MS方法能快速、簡便、安全、準(zhǔn)確鑒定屬水平沙門菌，是一種有效的沙門菌檢測鑒定的手段。

基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時間質(zhì)譜(MALDI-TOF-MS)；沙門菌；鑒定

沙門菌(Salmonella)種類繁多且結(jié)構(gòu)復(fù)雜，現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)超過2 500個沙門菌血清型，我國已發(fā)現(xiàn)血清型超過290個。沙門菌是常見的腸道致病菌之一，不僅可以引起家禽及動物發(fā)生感染，還能通過污染的食物導(dǎo)致人的食物中毒。在世界各國的各類細(xì)菌性食物中毒中，沙門菌引起的食物中毒常居榜首；我國內(nèi)陸地區(qū)以沙門菌為首位[1]。因此，建立一種快速而準(zhǔn)確的沙門菌檢測鑒定及分型方法具有重要意義。

目前，沙門菌的檢測和分型方法很多，主要包括傳統(tǒng)生化實驗、血清學(xué)分型、脈沖場凝膠電泳 (Pulsed Field Gel Electrophoresis，PFGE)分型和耐藥譜分型等。以細(xì)菌表面蛋白為檢測對象的基質(zhì)輔助激光解吸飛行時間質(zhì)譜(Matrix-assisted laser desorption ionization-time of light mass spectrometry，MALDI-TOF-MS)是近年來發(fā)展起來的一種新的微生物檢測技術(shù)，它是通過檢測未知微生物的蛋白質(zhì)指紋圖譜并與質(zhì)譜圖數(shù)據(jù)庫中特征性譜圖進(jìn)行對比，從而對待測微生物進(jìn)行快速鑒定[2]。它所具有的靈敏、準(zhǔn)確、自動化以及高通量等優(yōu)勢彌補了傳統(tǒng)檢測鑒定方法的缺陷，對致病菌的檢測與鑒定、分型及溯源有十分重要的意義。目前MALDI-TOF MS技術(shù)已經(jīng)成為商業(yè)的微生物鑒定技術(shù)[3]，但不同的培養(yǎng)基和樣品的前處理方式會影響MADLI—TOF MS鑒定細(xì)菌的結(jié)果[4-5]。本研究通過采用MALDI-TOF-MS對4株沙門菌標(biāo)準(zhǔn)菌株在不同培養(yǎng)基和不同前處理方式下進(jìn)行鑒定，并對結(jié)果進(jìn)行分析，尋找簡便、準(zhǔn)確的鑒定方式，并將血清學(xué)分型和MALDI-TOF-MS分型方法進(jìn)行比較，探討分型方法的可比性。

MALDI-TOF-MS在微生物鑒定領(lǐng)域應(yīng)用時間較短，對于MADLI靶板在使用過程中是否會污染外環(huán)境國內(nèi)尚未見報道，本研究對沙門菌鑒定的靶板進(jìn)行細(xì)菌培養(yǎng)，初步探討該技術(shù)方法的安全性。

1 材料與方法

1.1 菌株 4株沙門菌標(biāo)準(zhǔn)菌株(鼠傷寒沙門菌CMCC50013、乙型副傷寒沙門菌CMCC50004、傷寒沙門菌CMCC50071和鼠傷寒沙門菌ATCC14028)購置于中國工業(yè)菌種保藏中心、33株北京市朝陽區(qū)腹瀉病人糞便中分離的沙門菌。

1.2 培養(yǎng)基 營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基、XLD培養(yǎng)基、SS培養(yǎng)基、麥康凱培養(yǎng)基、哥倫比亞血瓊脂培養(yǎng)基(成品)，賽默飛世爾生物化學(xué)制品(北京)有限公司；沙門菌增菌液；沙門誘導(dǎo)培養(yǎng)基，北京陸橋技術(shù)有限公司。

1.3MALDI-TOF-MS基質(zhì)和溶液系統(tǒng) 甲酸(formic acid，F(xiàn)A)，Sigma，Germany；乙醇，Sigma，USA；三氟乙酸(trifluoracetic acid，TFA)，Sigma，Germany；乙腈(acetonitrile，CAN)，Dikmapure，USA；去離子水：通過Milipore過濾；基質(zhì)2-氰基-4-羥基肉桂酸( α-cyano-4-hydroxycinnamic acid，HCCA)、標(biāo)準(zhǔn)品和標(biāo)準(zhǔn)溶劑(德國布魯克公司)。(BrukerDaltonics)；沙門菌A～F多價、O、H血清(Statens serum institut，Danmark和寧波天潤生物藥業(yè)有限公司)；BD鑒定卡(Becton，Dickinson and Company)。

1.4 儀器 基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時間質(zhì)譜(MicroflexTMMALDI-TOF)和配套分析軟件(德國布魯克公司)，儀器參數(shù)為：氮氣激光光源，線性正離子(LP-BioTyper)采樣模式，質(zhì)量范圍2 000-20 000 D，激光隨機機打40/次，打5個點，激光頻率為60 Hz，每次實驗前用校準(zhǔn)品進(jìn)行質(zhì)量校正；全自動細(xì)菌生化鑒定儀(PhoenixTM100)(美國BD公司)。

1.5 菌株鑒定 33株受試菌株均按照《感染性腹瀉診斷標(biāo)準(zhǔn)WS271—2007》和《傷寒、副傷寒診斷標(biāo)準(zhǔn)及處理原則WS280—2008》中的檢測方法進(jìn)行生化反應(yīng)和血清學(xué)檢測鑒定為沙門菌。

1.6 鑒定條件的優(yōu)化

1.6.1 前處理條件的選擇

1.6.1.1 甲酸提取法：參考文獻(xiàn)[6]樣本制備的方法進(jìn)行MALDI-TOF MS檢測。

1.6.1.2 直接轉(zhuǎn)移法：參考文獻(xiàn)[7]對沙門菌鑒定的方法進(jìn)行MALDI-TOF MS檢測。

1.6.1.3 加熱提取法：向EP管中加入300 μL去離子水，取4株沙門菌標(biāo)準(zhǔn)菌株單一菌落至離心管中，充分混勻，在沸水浴中加熱 30 min，13 000 r/min離心2 min，棄上清。取沉淀均勻涂在靶板上，干燥后，在上述樣品上覆蓋1 μL HCCA基質(zhì)溶液，晾干后進(jìn)行檢測。

1.6.1.4 乙醇提取法 向EP管中加入300 μL75%乙醇，取4株沙門菌標(biāo)準(zhǔn)菌株單一菌落至離心管中，充分混勻，反應(yīng) 30 min后13 000 r/min離心2 min，棄上清。取沉淀均勻涂在靶板上，干燥后，在上述樣品上覆蓋1 μLHCCA基質(zhì)溶液，晾干后進(jìn)行檢測。

1.6.2 MALDI靶板污染情況比較 實驗完成后，將甲酸提取法、直接轉(zhuǎn)移法、加熱滅菌提取法、乙醇滅菌提取法點在MALDI靶板上的靶點用1 μL 生理鹽水溶解后，分別接種營養(yǎng)瓊脂和血平板，放置于37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h，觀察有無菌落生長，并進(jìn)行分純鑒定。

1.6.3 培養(yǎng)基的選擇 將4株沙門菌標(biāo)準(zhǔn)菌株復(fù)蘇后分別接種營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基、哥倫比亞血瓊脂培養(yǎng)基、XLD培養(yǎng)基、SS培養(yǎng)基、麥康凱培養(yǎng)基37 ℃培養(yǎng)18～24 h，用甲酸提取法上樣，每種菌株上3個靶點，MALDI-TOF-MS對每個靶點進(jìn)行5次鑒定和圖譜匹配性分析，重復(fù)實驗3次，得到每個標(biāo)準(zhǔn)菌株的平均匹配分?jǐn)?shù)。

1.7 菌株的鑒定 將33株北京市朝陽區(qū)腹瀉病患者糞便中分離的沙門菌菌株接種營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基于37 ℃培養(yǎng)18～24 h，用直接轉(zhuǎn)移法進(jìn)行質(zhì)譜鑒定。

2 結(jié) 果

2.1 條件優(yōu)化的結(jié)果

2.1.1 前處理方法

2.1.1.1 匹配分值 采用甲酸處理法、直接轉(zhuǎn)移法、加熱提取法和乙醇提取法鑒定沙門菌的匹配分值均>2.0，說明可以保守鑒定到菌屬，其中甲酸提取法和直接轉(zhuǎn)移法的分值均>2.3，說明鑒定到菌種的可信度高，見表1。

表1 不同前處理方式的鑒定分值Tab.1 Identification score value of different sample preparation methods

2.1.1.2 質(zhì)譜圖質(zhì)量 比較甲酸提取法、直接轉(zhuǎn)移法、加熱提取法和乙醇提取法這4種方法的圖譜發(fā)現(xiàn)峰形基本一致，但甲酸處理法的圖譜基線平穩(wěn)，雜峰相對較少(見圖1)。

2.1.2 培養(yǎng)基的選擇 5種培養(yǎng)基上培養(yǎng)的沙門菌在MALDI-TOF-MS檢測的匹配分值均>2.0說明可以保守鑒定到菌屬，其中營養(yǎng)瓊脂和XLD培養(yǎng)基上的各標(biāo)準(zhǔn)菌株在 MALDI-TOF-MS上的匹配分?jǐn)?shù)在>2.300，說明可準(zhǔn)確鑒定到種。具體數(shù)值見表2。結(jié)果表明：不同培養(yǎng)基上的沙門菌的指紋圖譜峰值強度有所差別，但是所獲取的圖譜均可以得到正確的鑒定結(jié)果。

2.2 沙門菌分離株鑒定結(jié)果 33株沙門菌均能鑒定到種屬水平。MALD-TOF-MS鑒定結(jié)果型別與血清型結(jié)果比較結(jié)果見表3。33株不同血清型的沙門菌中，用MALDI-TOF-MS鑒定結(jié)果為：19株鑒定結(jié)果與血清凝集結(jié)果一致，14株鑒定結(jié)果與血清凝集結(jié)果不一致。

圖1 不同處理方法的質(zhì)譜圖比較Fig.1 Mass spectra comparing of different pretreatment methods

表2 5種培養(yǎng)基上的菌株鑒定分值Tab.2 Identification score value in 5 kinds of culture medium

表3 沙門菌MALDI-TOF-MS鑒定結(jié)果與菌株的血清型結(jié)果比較Tab.3 Comparison of MALDI-TOF-MS and the serotype of Salmonella strains

3 討 論

MALDI-TOF-MS法作為一種快速鑒定微生物的方法得到廣泛應(yīng)用[8]，本文針對多種樣本前處理方法和5種常用培養(yǎng)基培養(yǎng)的沙門菌采用MALDI-TOF-MS進(jìn)行檢測鑒定，得到的結(jié)果與梁達(dá)煒等[7]研究結(jié)果基本一致，說明MALDI-TOF-MS可直接使用選擇性平板上沙門菌進(jìn)行鑒定，節(jié)省了檢測時間。

通過對不同血清型沙門菌的分析，本文研究結(jié)果表明使用MALDI-TOF-MS法進(jìn)行沙門菌血清分型鑒定與常規(guī)血清學(xué)凝集分型方法具有一定的相關(guān)性，但不能達(dá)到完全一致，與鄭秋月等[9]研究的結(jié)果一致，其主要原因其一是二者原理有所差異：常規(guī)血清學(xué)檢測是針對細(xì)菌細(xì)胞膜表面的抗原蛋白，而MALDI-TOF-MS檢測則針對的是細(xì)菌體內(nèi)所有的生物大分子，包括核糖體蛋白等。其二與MALDI-TOF數(shù)據(jù)庫容量有關(guān)，提示繼續(xù)補充沙門菌鑒定數(shù)據(jù)庫，對菌株進(jìn)行溯源分析，進(jìn)一步分析不同來源的沙門菌對MALDI-TOF-MS檢測分型的影響因素[10],以及不同耐藥譜對MALDI-TOF-MS的鑒定分型的影響[11]是今后的研究方向。

國內(nèi)尚沒有文獻(xiàn)報道MALDI-TOF-MS樣品前處理方法對MALDI靶板污染情況，使該方法的應(yīng)用存在一定生物安全隱患，本文初步探討了沙門菌不同前處理方法對MALDI靶板污染，說明使用不同的常規(guī)前處理方法均不會導(dǎo)致MALDI靶板污染，但因各種細(xì)菌對外界抵抗力的不同，其他非沙門菌是否會造成MALDI靶板污染尚需進(jìn)一步研究。

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DetectingSalmonellawithmatrixassistedlaserdesorptionionizationtimeofflightmassspectrometry

ZHAO Jian-hong1, GAO Yan1, LI Shu-ming1, ZHANG Shi-yao1, WANG Heng-wei1, GU Lin1, HAN Qing-hua1, JIAO Yang1, CHEN Qian2

(1.ChaoyangCenterforDiseaseControlandPrevention,Beijing100021,China；2.BeijingCenterforDiseaseControlandPrevention,BeijingCenterforPreventiveMedicalResearch,Beijing100013,China)

In order to optimize the matrix-assisted laser desorption ionization time of flight mass spectrometry (MALDI-TOF-MS) method forSalmonellaidentification, study the target board pollution situation of different pretreatment methods, and establish a safe and effective method for detection ofSalmonella, we applied MALDI-TOF-MS technique to detect 4 standard strains ofSalmonellaunder different culture conditions and sample preparation method, and established optimization program. MALDI target board was detected under different preparation treatments. The optimization method was used to detect 33 strainsSalmonellawhich isolated from diarrhea patients’ stool. Identification results were compared with serological results. The study found that MALDI-TOF-MS method could accurate identify ofSalmonellain different pretreatment methods and culture medium. Thirty-three strains ofSalmonellaidentified by MALDI-TOF-MS method were all accurate appraisal in genus level, 19 strains of them were completely consistent with the serotyping identification results, 14 strains of them were not consistent with the serotyping identification results. There was no bacteria growth on the target board in different pretreatment methods. MALDI-TOF-MS method can in a fast,convenient,safe and accurate way identifySalmonella, and it can become an effective means for identification ofSalmonella.

10.3969/j.issn.1002-2694.2017.08.008

北京市開放基金(No.2015BZ0063-03)

陳 倩，Email：cchenqian@263.net

1.北京市朝陽區(qū)疾病預(yù)防控制中心，北京 100021; 2.北京市疾病預(yù)防控制中心，北京市預(yù)防醫(yī)學(xué)研究中心，北京 100013

R378.2

：A

：1002-2694(2017)08-0705-05

2017-01-12編輯：梁小潔