基于COI基因片段的擬釘螺種類鑒定初探

柯雪梅，邱 旻，林陳鑫，葛 婧，郭志南，程明基，陳 清，陳國偉

基于COI基因片段的擬釘螺種類鑒定初探

柯雪梅1，邱 旻2，林陳鑫3，葛 婧2，郭志南1，程明基2，陳 清2，陳國偉1

目的探討COI基因片段在擬釘螺種類鑒定中的作用。方法收集來自福建省內多個地區的疑似擬釘螺標本，用形態學方法進行物種鑒定后，取出螺肉提取基因組DNA，通過PCR的方式擴增COI基因序列片段并測序，通過序列比對及系統進化分析鑒定其物種。結果共采集到標本13份，通過形態學方法將樣本鑒定為福建境擬釘螺屬。所有標本經實驗擴增到長度為515～598 bp的COI基因片段。13份標本中11株的COI基因片段與γ擬釘螺屬最為相似(88.96%～97.82%)，另外2株分別與擬釘螺屬下的武鳴擬釘螺(87.08%)及新擬釘螺屬下的開放新擬釘螺(88.55%)最為相似。在屬水平上，13份標本中僅有1份的形態學鑒定結果與基因鑒定結果吻合，其余12份樣本的形態學鑒定結果均與基因鑒定不同，兩種方法的鑒定結果存在較大差異。結論通過COI基因檢測可快速對擬釘螺亞科作出準確判斷，但對屬水平的鑒定的準確性還需要進一步的研究。

擬釘螺亞科;COI基因;物種鑒定

擬釘螺亞科(Triclulinae)隸屬中腹足綱(Gastropoda)、前鰓亞綱(Prosobranch)、圓口螺科(Pomatiopsidae)，目前主要分布于東南亞和中國南部[1]。已發現的擬釘螺亞科物種已達120種，其中在中國有近50 種，主要分布在長江流域地區及其以南的地區[1-2]。擬釘螺亞科的擬釘螺屬(Tricula)、γ擬釘螺屬(Gammatricula)以及新擬釘螺屬(Neotricula)被認為是裂體屬亞洲組血吸蟲和(或)并殖吸蟲的重要中間宿主[3-5]，因此，掌握并了解擬釘螺亞科種類的分布情況對監控與預警上述兩種寄生蟲病有著重要的意義。傳統的擬釘螺亞科物種鑒定方法采用形態學鑒定法，即按照螺個體的外殼特征和齒舌特征對其進行分類。但由于螺個體較小，部分形態學特征差異難以正確分辨，給分類工作帶來很大的困難，容易錯分。故近來許多學者開始使用分子標記即基因分類法作為分類研究的重要手段。細胞色素C氧化酶亞單位I(Cytochrome c oxidase subunit I，COI)基因是所有分子標記中使用較為廣泛的一種。本文報告了一種基于COI基因的擬釘螺亞科物種分類方法，并對該方法在擬釘螺亞科物種鑒定中的應用價值做了初步探討。

1 材料與方法

1.1 樣本采集 從廈門市、福州市、漳州市、南平市等4市的淡水河(溪)流中采集疑似擬釘螺亞科物種共計13份，每份約100～150只螺。采集到的樣本在經清水清洗后，進行初步的形態學鑒定。鑒定完畢后的螺體浸入75%乙醇溶液，置于-80 ℃冰箱凍存備用。

1.2 基因組DNA提取 從每份樣本中取5～10枚擬釘螺，去除螺殼及其內臟，使用Earl’s平衡鹽溶液洗凈后一并置于研缽中研磨，將研磨后的螺體溶于Earl’s平衡鹽溶液制成勻漿液。取200 μL勻漿液，使用Promega DNA extraction kit提取其中的總基因組DNA。提取到的DNA經檢純度、濃度合格后貯藏于-20 ℃冰箱備用。

1.3COI基因片段擴增及產物鑒定 采用Davis等[6]設計的針對擬釘螺COI基因設計的PCR引物對獲得的基因組核酸進行擴增，正向引物序列為：5′-GGTCAACAAATCATAAAGATATTGG-3′，反向引物序列為：5′-TAAACTTCAGGGTGACCAAAAAAYCA-3′，擴增的目標片段的大小為598 bp。采用Promega公司的Master Green Mix試劑盒，參照使用說明構建如下25 μL反應體系：Master Green Mix 12.5 μL，正向引物1.0 μL，反向引物1.0 μL，DNAase Free Water 8.5 μL，基因組DNA2.0 μL。具體PCR反應流程如下：94 ℃預變性10 min，之后94 ℃ 1 min，51 ℃ 1 min 30 s，72 ℃ 1 min 45 s，循環40次, 最后72 ℃延伸10 min。擴增反應完成后，取5 μL產物進行1%瓊脂糖凝膠電泳，于紫外燈下觀察是否擴增成功。

1.4 擴增子測序及比對 擴增產物送至華大基因公司進行切膠純化及回收后，使用前述引物進行雙向序列測定(采用sanger法)，使用Bioedit[7]軟件對原始序列進行拼接，獲得相應COI基因序列片段。之后使用Bioperl[8]軟件將獲得序列提交NCBI服務器進行BLAST比對，選取BLAST report中的最優結果對應的物種名稱作為樣品的參考。

1.5 基因序列分析 依據關飛等[1]的報道，選取我國境內5個省(福建、廣西、湖北、浙江、四川)的12種擬釘螺相應的同源區段作為參考序列，并選擇我國境內常見的湖北釘螺(Oncomelaniahupensis)作為外群。與本實驗中獲得的COI基因片段組成數據庫進行序列分析：1)使用MEGA7.0[9]軟件進行多序列比對；2)基于比對結果計算序列一致性情況；3)根據比對結果進行核苷酸替換模型測試，使用最適的替換模型計算參考序列與檢出序列間的進化距離并構建距離矩陣；使用NJ(Neighbor-Joining)法構建系統進化樹，并進行1 000次Bootsrap迭代檢驗進化樹的可靠性。

2 結 果

2.1 標本采集及鑒定情況 本研究中采集的13份標本的具體采集地點見表2。

2.1.1 形態學鑒定 根據擬釘螺個體大小，外殼特征及齒舌情況等，將本次采集到的擬釘螺標本鑒定為此前在福建境內多有發現的6種擬釘螺屬物種，見表1，圖1。

2.1.2 分子鑒定 從13份標本的DNA中均擴增出符合預期大小的COI基因片段(515～598 bp)。經BLAST比對鑒定，11份樣品的最優結果為γ擬釘螺屬(Gammatricula)。其中采自廈門、福州以及漳州市的標本序列一致性較高，達94.17%～97.82%，而采自南平市的標本序列比對一致性只有87.08%～88.96%。另外，采自南平的NPQ-1的最優結果為武鳴擬釘螺(Triculawumingensis)序列一致性為87.08%，而同為南平的NPQ-2的最優結果為開放新擬釘螺(Neotriculaaperta)序列一致性為88.55%。13份標本中，僅有NPQ-2的2個鑒定結果在屬水平一致，但種水平不一致。其它12份均在屬水平上不一致，但未有亞科水平結果不一致的情況。

表1 福建省幾種擬釘螺的形態特征比較Tab.1 Diagnosis features of Triculinae collected in Fujian Province

1-1小橋擬釘螺1-1 T.xiaoqiaoensis

1-2建甌擬釘螺1-2 T.jianouensis

1-3福建擬釘螺1-3 T.fujianensis

1-4 翔安擬釘螺1-4 T.xiananensis

1-5新店擬釘螺1-5 T.xindianensis

1-6 華安擬釘螺1-6 T.huaanensis

1-7翔安擬釘螺齒舌帶

表2 福建境內采集疑似擬釘螺亞科物種標本的鑒定結果Tab.2 Classification of Triculinae collected in Fujian Province

2.2 系統進化分析 本研究中采用的參考序列的名稱、來源地區以及GenBank登錄號見表3。

表3 研究中使用的擬釘螺參考序列信息Tab.3 Reference sequences used in this study

經計算，本次研究中的序列集最適用的替換模型為Tamura 3-parameter，故使用此模型估算各序列間的進化距離，并構建NJ樹如圖2。從計算結果看，本實驗中采集的大部分擬釘螺與我國境內原先報道的擬釘螺在基因水平上有一定差異，COI基因序列一致性在85%～90%之間，進化距離為0.109～0.201不等。從進化樹上可見，除南平七里街(NPQ-1 NPQ-2)的2份標本與武鳴擬釘螺聚為一支外，其它株均不與國內已知的任何一種擬釘螺聚為一支，而是獨自成支，本研究中采集樣本的序列相互之間相似度高，進化距離較近，相關分支的bootstrap值較高，表明該聚類結果較為可靠。

(帶“▲”為本次研究中獲得序列)(Sequences originally obtained in this study were marked with “▲”)圖2 實驗獲得COI基因序列與參考序列通過鄰接法構建的系統進化樹Fig.2 NJ-Tree based on partial sequences of COI gene obtained in this study and reference sequences

3 討 論

在本研究中，形態學鑒定和基因鑒定在擬釘螺亞科水平上鑒定結果完全一致，但是在屬鑒定的結果間存在著較大的差異，這種差異的來源可能有如下幾點：

首先，形態學的鑒定方法依賴物種間表觀形態上的差異。對于擬釘螺這種個體特別小的淡水螺來說，其外殼、齒舌等特征差異并不明顯，這無疑使鑒別工作變得十分困難。即使在李翠娥[10]等提出以細部解剖資料作為依據進行鑒別參考后，僅從形態及解剖學上對擬釘螺進行精細區分仍然困難重重。而小橋擬釘螺、建甌擬釘螺、華安擬釘螺等在最初被記述、分類并命名時，往往僅以形態學與解剖學特征為基礎[11-12]，加之過去研究中確實多有發生僅依靠外觀而錯判為擬釘螺屬的情況[10]，因此，對于廈門、福州、漳州采集的7份標本，傾向于認為系最初分類的偏差及命名的錯誤導致了形態學鑒定上的偏差，這7份標本實際上應該屬于γ擬釘螺。

另一方面，基于分子標記的分子鑒別方法雖然簡單易行，但在實際應用中也需進一步評價和完善。該方法的本質是通過比對，尋找已知數據庫內與被提交序列最為相似者，然后以這條序列的注釋信息作為鑒定結果。這種方法的準確性依賴于兩個重要因素：①提交序列本身的測序質量；②已知數據庫的完備與準確。對于前者，由于實際樣本情況的差異與實驗條件的限制，難以保證所有樣品的測序都能達到高質量且均一；至于后者，由于分子標記鑒定相關數據庫仍在發展及完善中，難免出現庫中數據不全或者不準確的情況。Buhay[13]等就曾提及現有的包含COI基因的數據庫如NCBI Genbank及Barcode of Life(BOL)等在進行數據收錄時并未收集數據的質量信息，因此研究者若想使用，只能自己進行相關的質控與篩選工作。綜上，若相關方法及數據庫在某一個物種上尚不成熟，則基因鑒定同樣會出現偏差。比如本研究中所有采自南平的標本，雖然都能通過BLAST獲得注釋結果，但由于序列一致性并不算特別高，故不排除由于數據庫不完備而發生了注釋上的偏差的可能。因此相關的6份標本尚無法判明種屬。

本研究表明，用COI基因片段對擬釘螺種類進行鑒定，在亞科水平上可得到與形態學鑒定完全一致的結果。但是在屬鑒定水平上則差異較大。提示在基因鑒定方面仍需開展更多研究，例如選用多個分子標記聯合判斷、不斷完善擬釘螺亞科相關的基因數據庫信息等。

[1] Guan F. Molecular systematic study on some species of Triculine[D]. Wuhan: Huazhong University of Science & Technology, 2009. (in Chinese)

關飛. 擬釘螺亞科部分種類分子系統發育研究[D]. 武漢：華中科技大學,2009.

[2] Liu L, Huo G, He H, et al. A phylogeny for the pomatiopsidae (Gastropoda: Rissooidea): a resource for taxonomic, parasitological and biodiversity studies[J]. BMC Evolutionary Biol, 2014, 14(1): 29. DOI: 10.1186/1471-2148-14-29

[3] Li YS, Zen SP, Zhang SY, et al. Investigation on the first intermediate host of paragonimus and its geographic distribution and infection rate in Fujian, China[J]. Strait J Prevent Med, 2004, 10(06): 1-3. (in Chinese)

李友松，曾森平，張世陽，等. 福建省并殖吸蟲第1中間宿主種類、分布及感染率的調查[J]. 海峽預防醫學雜志,2004.10(06):1-3.

[4] Guo YH, Gu JR, Chen PL, et al. Study onTriculaand the related schistosomes[J]. Chin J Schistosomiasis Ctrl,1989, 1(1): 22-27. (in Chinese)

郭源華，顧金榮，陳溥林，等. 擬釘螺及其有關血吸蟲的研究[J]. 中國血吸蟲病防治雜志,1989.1(1):22-27.

[5] Guo YH, Ni CH, Xia F, et al. Tricula and its importance on medicine[Z]. Huanshan Anhui China: 1988.

[6] Davis GM, Wilke T, Zhang Y, et al. Snail-Schistosoma,Paragonimusinteractions in China: population ecology, genetic diversity, coevolution and emerging diseases[J]. Malacologia, 1999, 41(2): 355-377.

[7] Hall TA. BioEdit: a user-friendly biological sequence alignment editor and analysis program for Windows 95/98/NT[C]. 1999.

[8] Stajich JE, Block D, Boulez K, et al. The Bioperl toolkit: Perl modules for the life sciences[J]. Genome Res, 2002, 12(10): 1611-1618. DOI: 10.1101/gr.361602

[9] Tamura K, Dudley J, Nei M, et al. MEGA4: molecular evolutionary genetics analysis (MEGA) software version 4.0[J]. Mol Biol Evolut, 2007, 24(8): 1596-1599. DOI: 10.1093/molbev/msm092

[10] Chen CE, Kang ZB, Liu YY. Snail hosts ofParagonimusin Asia and America[J]. Chin J Parasitol Parasot Dis,1994, 4(12): 279-284. (in Chinese)

陳翠娥，康在彬，劉月英. 亞洲和美洲的并殖吸蟲的螺類宿主[J]. 中國寄生蟲學與寄生蟲病雜志,1994.4(12):279-284.

[11] Li YS, Lin CX, Zhou XM, et al. A new species of the Triculinae of freshwater snails that harbours cercariae of lung flukes from Fujian, China.[J]. Chin J Zoonoses, 2004, 10(20): 883-884. (in Chinese)

李友松，林陳鑫，周憲民，等. 攜帶肺吸蟲尾蚴的淡水螺類擬釘螺亞科一新種(前鰓亞綱;中腹足目;圓口螺科;擬釘螺亞科)[J]. 中國人獸共患病雜志,2004.10(20):883-884.

[12] Cheng YZ, Wu XP, Li LS. Two new species ofTricula(Mesogastroppda, Pomatiopsidae) from China[J]. Zoologic Systematics, 2010, 4(35): 871-875.

[13] Buhay JE. “COI-like” sequences are becoming problematic in molecular systematic and DNA barcoding dtudies[J]. J Crustacean Biol, 2009, 29(1): 96-110. DOI: 10.1651/08-3020

Chen Guo-wei, Email: xmcdcxsk@163.com

SpeciesidentificationofTriculinaebasedonCOIgenesegment，FujianProvince

KE Xue-mei1, QIU Min2, LIN Chen-xin3, GE Jing2, GUO Zhi-nan1, CHENG Ming-ji2, CHEN Qing2, CHEN Guo-wei1

(1.XiamenCenterforDiseaseControlandPrevention,Xiamen361021,China; 2.PublicHealthCollegeofSouthernMedicalUniversity,Guangzhou510515,China; 3.FujianCenterforDiseaseControlandPrevention,Fuzhou350001,China)

The aim of the study is to evaluate the utility value of species identification of Triculinae based onCOIgene. Triculinae-like samples were collected from different places in Fujian Province. After classification based on morphology characters, genomic DNA was extracted from collected samples. Then the segments ofCOIgene were amplified and sequenced for taxonomy annotation and phylogenetic analysis. Eleven samples were annotated asGammatricula(identities: 88.96%-97.82%), the other two were annotated asTriculawumingensis(identity: 87.08%) andNeotriculaapart(identity: 88.55%), respectively. In most cases (12 out of 13), there was a difference between results based on different classification methods on a genus level. The alignment ofCOIgene segment is sufficient for preliminary identification of Triclulinae at family level. However, it is need further study in species identification of Triclulinae at genus level.

Triclulinae;COI; species classification phylogenetic

10.3969/j.issn.1002-2694.2017.08.012

福建省科技廳項目(No.2011D015)

陳國偉，xmcdcxsk@163.com

1.廈門市疾病預防控制中心，廈門 361021; 2.南方醫科大學公共衛生學院，廣州 510515； 3.福建省疾病預防控制中心，福州 350001

Supported by the Science and Technology Agency og Fujian Province (No. 2011D015)

R38

：A

：1002-2694(2017)08-0724-06

2016-11-03編輯：劉岱偉