青藤堿對H2O2誘導人肝細胞損傷的保護作用研究

王效蕊 梁泰剛

（山西醫科大學藥學院，山西 太原 030001）

青藤堿對H2O2誘導人肝細胞損傷的保護作用研究

王效蕊 梁泰剛*

（山西醫科大學藥學院，山西 太原 030001）

目的研究青藤堿對H2O2誘導人肝細胞（HLO2）損傷的保護作用。方法以H2O2損傷HL02細胞建立氧化應激模型，MTT法檢測細胞存活率；Annexin V-FITC/PI雙染法檢測細胞凋亡率。結果青藤堿能明顯改善H2O2誘導的細胞損傷，與模型組相比，青藤堿可提高細胞存活率，降低細胞的凋亡率。結論青藤堿對H2O2所致的HL02細胞損傷具有明顯的保護作用。

青藤堿；H2O2；HL02；細胞損傷；凋亡

作為人體最主要的代謝器官，肝臟容易受到各種因素所導致的損傷，而肝損傷是導致肝硬化甚至肝癌的直接病因[1]。目前研究表明，氧化應激與肝損傷密切相關，氧化應激可以啟動膜脂質過氧化，從而破壞肝細胞的功能和結構，最終導致細胞損傷和死亡[2]。近年來，人們發現一些天然活性物質能夠通過降低氧化應激水平發揮肝保護作用[3]。

青藤堿（sinomenine）是從防己科植物青藤及毛青藤的干燥藤莖中提取的一種生物堿單體。青藤堿生物活性很多，包括抗炎、抗心律失常、鎮痛、降壓、免疫抑制等多種藥理作用，除此之外，青藤堿還具有清除氧自由基和抗氧化作用[4-5]。本文以H2O2刺激HL02細胞建立肝細胞氧化應激損傷模型，旨在研究青藤堿對體外肝損傷的保護作用。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 儀器：CO2培養箱（Heal Force HP90，上海力申科學儀器有限公司）；垂直層流超凈臺（Boxun，上海楚柏實驗室設備有限公司）；流式細胞儀（BD-C6，USA）；Variskan Flash全波長多功能酶標儀（Thermo Scientific）。

1.1.2 細胞株：HL02細胞株購于中國科學院細胞庫。

1.1.3 試劑：青藤堿（上海阿拉丁試劑有限公司，純度＞97%）；含EDTA的胰酶、無EDTA的胰酶、青鏈霉素雙抗混合液、1640培養基、胎牛血清（Invitrogen Life Technologies，Inc.，USA）；噻唑藍（Sigma，USA）；雙染凋亡檢測試劑盒（江蘇凱基生物技術股份有限公司）；其他試劑均為分析純。

1.2 方法

1.2.1 細胞的培養：HL02細胞置于含10%胎牛血清的1640培養基中，在5% CO2，37 ℃培養箱中培養，1～2 d換液1次，2～3 d傳代1次，10代以內細胞用于下述實驗。

1.2.2 H2O2誘導HL02細胞損傷模型的建立：加入終濃度為200、400、600 μmol/L H2O2，同時設陰性對照組，每組為4個復孔，繼續培養6 h，檢測細胞存活率[6]，確定H2O2最佳損傷作用濃度。

1.2.3 MTT實驗：處于對數期生長的細胞用胰酶消化后，按5×104個/孔接種于96孔板中，培養24 h后，先加入不同濃度（5、10、20 μmol/L）青藤堿培養12 h，再加入終濃度為400 μmol/L H2O2共同培養6 h，檢測細胞存活率。

1.2.4 Annexin V-FITC/PI 雙染法：消化后的細胞，直接種于6孔板中，每孔1×105個/孔，細胞經青藤堿和H2O2處理后（按照MTT實驗中的處理步驟），用無EDTA的胰酶消化收集細胞，PBS沖洗3遍，再重懸于200 μL binding buffer溶液中，每個樣本加入5 μL Annexin V和5 μL PI，避光培養15 min，在1 h內上機檢測[6]。

2 結 果

2.1 H2O2誘導HL02細胞損傷模型的建立：細胞活力檢測結果表明H2O2可以濃度依賴性地損傷HL02細胞（表1），根據結果本研究選用H2O2400 μmol/L為最佳作用濃度。

2.2 青藤堿對H2O2誘導HL02細胞活力下降的影響：與陰性對照組相比較，模型組的細胞存活率下降為（56.31±2.43）%（P＜0.01），加入不同濃度的青藤堿保護后，細胞活力依次明顯上升（表2）。

2.3 青藤堿對H2O2誘導HL02細胞凋亡的影響：見表2。H2O2培養細胞6 h細胞的凋亡率為（25.07±1.50）%，與陰性對照組相比具有明顯的差異，加入不同濃度的青藤堿后，細胞凋亡率逐漸下降，并且具有劑量依賴性。

表1 H2O2對正常HL02細胞損傷的影響（）

表1 H2O2對正常HL02細胞損傷的影響（）

注：與陰性對照組相比，##P＜0.01

表2 青藤堿對H2O2誘導HL02細胞活力和凋亡率變化的影響（

表2 青藤堿對H2O2誘導HL02細胞活力和凋亡率變化的影響（

注：與陰性對照組相比，##P＜0.01，與模型組相比，*P＜0.05，**P＜0.01

青藤堿濃度(μmol/L) 細胞存活率(%) 總凋亡率(%)陰性對照組 - 100 4.63±3.10 56.31±2.43## 25.07±1.50##5 64.44±1.56* 20.05±1.92* 10 74.90±4.19** 14.16±2.26** 20 83.84±3.74** 12.74±0.65** 0 H2O2處理組

3 討 論

氧化應激是細胞內的抗氧化系統和氧化系統失衡造成細胞氧化損傷的一種現象。肝細胞的氧化損傷是酒精性肝病、自身免疫性肝疾病、慢性毒性肝炎、肝硬化甚至肝癌等多種肝性疾病的共同特征，與肝組織壞死、細胞凋亡、肝功能下降密切相關[7-8]。

本實驗以H2O2損傷HL02細胞為損傷模型，研究青藤堿對H2O2損傷細胞的保護作用。細胞活力測定實驗表明青藤堿可以濃度依賴性地抑制H2O2誘導細胞活力的下降。流式雙染法是經典的測定細胞凋亡率的方法，結果表明青藤堿可以減少H2O2誘導的細胞凋亡率的升高。初步認為青藤堿可以保護H2O2誘導的HL02細胞損傷。本實驗結果提示青藤堿可用于預防肝性疾病的發生，其具體作用機制有待進一步研究。

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1671-8194（2017）19-0052-02

山西省2014年高校優秀青年學術帶頭人才項目資助；國家自然基金（NO81101687）資助

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