HAI-1與子宮內膜癌侵襲轉移的相關性研究

金 瓊 繆 飛 黃 勉 孫蓬明*

（1 福州市第一醫院婦產科，福建 福州 350009；2 福建省婦幼保健院婦科，福建 福州 350001）

HAI-1與子宮內膜癌侵襲轉移的相關性研究

金 瓊1繆 飛1黃 勉1孫蓬明2*

（1 福州市第一醫院婦產科，福建 福州 350009；2 福建省婦幼保健院婦科，福建 福州 350001）

目的探討HAI-1表達水平與子宮內膜癌細胞株侵襲遷移能力的相關性。方法體外培養人子宮內膜癌細胞株，采用Real-time q PCR技術檢測HEC-1A、HEC-1B和RL952三株子宮子宮內膜癌細胞中HAI-1 mRNA表達水平，應用細胞劃痕實驗及穿膜小室實驗，觀察三株子宮內膜癌細胞體外的侵襲及遷移能力。結果①HAI-1 mRNA在三株細胞中的相對表達量分別為（0.3042±0.0101）、（0.0032 ±0.0001）和（0.2580±0.0096），HAI-1蛋白在HEC-1A、HEC-1B和RL952中均呈陽性表達，但在HEC-1B中表達低于HEC-1A及RL952。②細胞劃痕實驗結果顯示，HEC-1A、HEC-1B和RL952三組遷移距離分別為（173.30±7.33）μm、（437.00±8.72）μm和（135.30 ±6.89）μm。③侵襲實驗結果顯示，HEC-1A、HEC-1B和RL952三組穿膜細胞數分別為（52.67±2.73）、（117.30±3.48）和（62.00±3.06）。結論HAI-1 mRNA表達水平與子宮內膜癌細胞侵襲遷移能力呈負相關。對HAI-1抑癌機制的進一步研究，將有望使HAI-1成為今后子宮內膜癌診斷及治療中的新靶點。

HAI-1基因；子宮內膜癌；轉移；侵襲

子宮內膜癌是發生于子宮內膜的一組上皮下腫瘤，為女性生殖道三大惡性腫瘤之一，占女性全省惡性腫瘤7%，近年來發病率呈逐漸上升趨勢[1]。子宮內膜癌的侵襲和轉移是其作為惡性腫瘤重要的生物學特性。細胞外基質（the extracellular matrix，ECM）的降解有利于腫瘤細胞的分離、種植及遠處播散，是侵襲轉移的關鍵環節。近年研究發現，一種肝細胞生長因子活化因子抑制劑1（hepatocyte growth factor activator inhibitor-1，HAI-1）構成了一個ECM 降解系統[2-3]。肝細胞生長因子激活物抑制因子（HAI）是目前公認的腫瘤抑制因子，它分為HAI-1和HAI-2兩種類型，HAI-1定位于染色體15q15，基因由11個外顯子組成，長度為12 kbp，在人的HAI-1的5'端調控區包含組織損傷的早期反應轉錄因子（如：熱休克蛋白轉錄因子、NFk-B、Egrs等的結合位點）可能是轉錄調節相關的TATA盒[4]，目前國內外很少做HAI-1與子宮內膜癌侵襲轉移相關性的研究。因此，本研究主要是通過檢測HEC-1A、HEC-1B 和RL952三株子宮內膜癌細胞中HAI-1的mRNA表達水平，同時研究HAI-1基因表達的差異與子宮內膜癌細胞體外侵襲遷移能力的相關性。

1 材料與方法

1.1 材料來源

1.1.1 細胞系：人子宮內膜癌細胞株HEC-1A、HEC-1B和RL952細胞購自中國科學院典型培養物保藏委員會細胞庫，由福建省婦幼保健院婦科腫瘤實驗室保存。

1.1.2 主要試劑：DMEM高糖培養基、DMEM/F12培養基、胰蛋白酶（美國Gibco 公司），Trizol 試劑（美國Invitrogen 公司），PCR試劑（北京TIANGEN 公司），逆轉錄試劑盒和熒光定量PCR試劑盒（美國Promega 公司）。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養：HEC-1A和HEC-1B細胞用含有10%滅活小牛血清、100 IU/mL青霉素、100 μg /mL鏈霉素的DMEM高糖培養基；RL952細胞采用含10%滅活小牛血清、100 IU/mL青霉素、100 μg/mL鏈霉素、NaHCO3及胰島素的DMEM/F12培養基，置37 ℃、5%CO2飽和濕度的培養箱內培養。

1.2.2 熒光定量：PCR Trizol 法提取RNA，用紫外分光光度計測定濃度及純度。根據說明書操作將RNA 合成cDNA 第一鏈。采用LightCycler SYBR Green I Master 試劑，進行熒光定量PCR。引物序列及擴增序列長度如下：HAI-1：上游5'-GGCAACAAGAACAACTTTGAGGAGGCAACAAGAACAACTTTGAGGA-3'，下游5'-CAATGCAGATGACCAG GAACAC-3'（154bp）；GAPDH：上游5'-GCACCGTCAAGGCTGAG AAC-3'，下游5'-TGGTGAAGACGCCAGTGGA-3'（138bp）。反應參數：預變性95 ℃，5 min；之后每一步變性95 ℃，10 s；退火60 ℃，10 s；延伸72 ℃，10 s共進行45個循環。每次在延伸階段讀取吸光值。采用雙標準曲線法，計算各目的基因的相對含量。

圖3 子宮內膜癌細胞株HEC-1A、HEC-1B及RL952侵襲情況圖

1.2.3 劃痕試驗：用Image J軟件測量各個時間點的劃痕兩側的細胞間距離（μm）變化，以0 h劃痕邊沿的距離減去24 h遷移邊沿的距離來計算細胞的遷移距離，反映細胞的遷移能。

1.2.4 Transwell小室侵襲實驗：Transwell小室直徑上取5個視野，照相，計數每個視野穿過膜的細胞數，取其平均值，結果以表示。以穿膜細胞數反映腫瘤細胞的侵襲能力。

1.3 統計學處理：采用SPSS19.0統計軟件。上述實驗均重復3次，實驗數據以表示，計量資料進行單因素方差分析，雙變量相關分析采用Person分析。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 熒光定量：PCR檢測HAI-1 mRNA在HEC-1A、HEC-1B、RL952細胞中表達情況，HAI-1 mRNA相對表達量分別為（0.3042±0.0101）、（0.0032±0.0001）和（0.2580±0.0096），HEC-1B組HAI-1表達情況顯著低于HEC-1A組（P＜0.0001）及RL952組（P＜0.0001） （圖1），實驗重復3次。

圖1 子宮內膜癌細胞株HEC-1A、HEC-1B及RL952中HAI-1mRNA表達情況圖

2.2 劃痕實驗：檢測HEC-1A、HEC-1B及RL952子宮內膜癌細胞的轉移情況。結果顯示三株內膜癌細胞遷移距離分別為（173.30 ±7.33）μm、（437.00±8.72）μm和（135.30±6.89）μm，HBC-1B組的子宮內膜癌細胞株的轉移能力顯著高于HEC-1A組（P＜0.0001）及RL952組（P＜0.0001），HEC-1A轉移能力稍高于RL952（P=0.00194）（圖2），實驗重復3次。

2.3 Transwell小室法：檢測HEC-1A、HEC-1B及RL952子宮內膜癌細胞的侵襲情況。結果顯示三株內膜癌細胞數分別為（52.67± 2.73）、（117.30±3.48）和（62.00±3.06），HEC-1B組的子宮內膜癌細胞株的侵襲能力顯著高于HEC-1A組（P=0.0001）及RL952組（P=0.0003），HEC-1A與RL952無顯著差異（P=0.0849）（圖3），實驗重復3次。

3 討 論

圖2 子宮內膜癌細胞株HEC-1A、HEC-1B及RL952轉移情況圖

肝細胞生長因子激活物抑制因子1（HAI-1）是一類細胞膜相關的Kunitz型絲氨酸蛋白酶的抑制因子，它可抑制多種絲氨酸蛋白酶的活性[5]。研究證明HAI-1是一種內源性的抑制因子，HAI-1最初是作為肝細胞生長因子激活物（HGFA）的抑制劑被發現的，后續發現其可抑制matriptase、胰蛋白酶、纖溶酶（plasmin）等的活性[6-8]。相關研究發現matriptase在婦科惡性腫瘤均呈現異常表達。Nakamura K等發現HAI-1在宮頸癌中低表達，HAI-1可作為宮頸癌治療靶點和良好預后指標[9]。進而，HAI-1在多種腫瘤中均發現起表達失調，張位星等[10]研究證實在肺癌組織中，隨著惡性程度的增加，HAI-1的表達下降，其下降會增加肺癌細胞的轉移可能性，使腫瘤惡性程度提高。其可能的機制是上調的HGFA（hepatocytegrowth factor activator）的激活不受抑制，進而使HGF的激活上調從而促進腫瘤細胞的增生，運動能力增強，細胞分化受影響。ST14基因最初是作為促進腫瘤轉移基因研究的，HAI-1是其蛋白產物的抑制劑，可能參與促進細胞分化成熟，并且其表達降低可能促進腫瘤的轉移。Zeng等[11]發現在胃癌和大腸癌組織中HAI-1的表達顯著低于相應的鄰近的正常組織，并且HAI-1的表達下降可能與腫瘤的侵襲和淋巴結轉移有關；HAI-1對Matriptase的抑制作用在轉基因小鼠模型中得到進一步證實，HAI-1的過表達可以完全抑制Matriptase誘導的皮膚癌的發展[12]；在乳腺癌的研究中，Parr等[13]通過檢測乳腺癌組織，研究發現HAI-1 mRNA的表達明顯高于正常乳腺對照組織，HAI-1 mRNA在低分化腫瘤中的表達顯著降低，而分化較好的腫瘤則表達較高，HAI-1mRNA的表達與乳腺癌的分化呈正相關，因此也說明HAI-1可能可以作為腫瘤細胞的分化指標之一。

本次研究中發現，HAI-1在子宮內膜癌細胞株HEC-1A、HEC-1B和RL952中，HEC-1B中HAI-1的表達明顯低于HEC-1A和RL952，然而HEC-1B的侵襲轉移能力卻顯著強于HEC-1A和RL952，進而說明HAI-1的表達情況與子宮內膜癌的侵襲轉移關系密切，HAI-1有可能直接或者間接抑制子宮內膜癌細胞，進而調控其侵襲轉移能力。Nakamura等[14]通過檢測子宮內膜癌細胞株HAI-1的表達情況中發現HAI-1無表達或低表達，說明HAI-1在子宮內膜癌中充當著抑癌基因的作用，在子宮內膜癌細胞系KLE和HEC-251轉染HAI-1后發現HAI-1明顯抑制matriptase的表達。并且發現HAI-1在細胞增殖、侵襲和轉移過程中是通過抑制matriptase和hepsin表達來實現的。這也進一步證實我們的研究結論。

綜上所述，HAI-1在子宮內膜癌細胞中的表達與子宮內膜癌細胞侵襲遷移能力呈負相關，HAI-1作為子宮內膜癌的抑制基因。從而表明子宮內膜癌中HAI-1表達可能與腫瘤細胞惡性侵襲特性有關，并與患者的預后、腫瘤復發有著緊密聯系，然而腫瘤的侵襲和轉移是一個復雜的病理過程，但為了但全面完善評估HAI-1在子宮內膜癌侵襲轉移過程中的角色，正常子宮內膜細胞的對比、組織學研究以及動物體內實驗都是必不可少。總之，HAI-1與子宮內膜癌的侵襲轉移過程密切相關，由此可以推斷通過檢測HAI-1基因和蛋白的表達水平的高低有助于判斷子宮內膜癌患者發生侵襲轉移的風險性，并且這將可能成為判斷腫瘤腫瘤侵襲轉移及預后的新指標。

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The Relationship between HAI-1 and the Invasion and Migration of Endometrial Cancer Cells

JIN Qiong1, MIAO Fei1, HUANG Mian1, SUN Peng-ming2

(1 Department of Gynecology and Obstetrics, The First Hospital of Fuzhou, Fuzhou 350009, China; 2 Department of Gynecology, Fujian Province Maternal and Child Health Hospital, Fuzhou 350001, China)

ObjectiveTo explore the relationship between HAI-1 and the invasion and migration of endometrial cancer cells.MethodsDetect three endometrial cancer cells(HEC-1A, HEC-1B and RL952) mRNA expression level of HAI-1 by Q-RTPCR. Then, the ability of invasion and migration were compared between the three endometrial cancer cells using scratch assay and transwell chamber assay separately.Results①The relative expression of HAI-1 mRNA in three cells was(0.3042±0.0101), (0.0032±0.0001), (0.2580±0.0096), HAI-1 protein was positive in HEC-1A, HEC-1B and RL952, but was lower than HEC-1A and RL952 in HEC-1B. ②The scratch assay showed that the migration distance of HEC-1A, HEC-1B and RL952 were(173.30±7.33)μm, (437.00±8.72)μm and (135.30±6.89)μm. ③The millicell chamber invasion assay showed that the ability of invasion were (52.67±2.73), (117.30±3.48) and (62.00±3.06).ConclusionThe invasion and migration of endometrial cancer cells was negative related with the HAI-1 expression, Further study on the mechanism of HAI-1 tumor suppressor is expected to make HAI-1 is expected to be a new target in the diagnosis and treatment of endometrial carcinoma in the future.

HAI-1; Endometrial cancer; Invasion; Migration

R737.33

B

1671-8194（2017）19-0001-03

福州市科技計劃項目（2015-S-140-4）

*通訊作者：E-mail:sunfemy@hotmail.com