解淀粉芽孢桿菌LX—J1及其菌肥防治花生白絹病效果研究

楊娜+李麗艷+孫杉杉+肖艷+徐延平

摘要：研究了解淀粉芽孢桿菌LX-J1及其復(fù)合微生物肥料對花生白絹病的防治效果和對花生苗期生長的影響。采用平板對峙法，測定了LX-J1對強致病性花生白絹病菌的拮抗效果；在溫室盆栽條件下，用LX-J1發(fā)酵原液及其復(fù)合微生物肥料處理了接種花生白絹病菌的培養(yǎng)基質(zhì)，并測定了二者對白絹病菌的防效及苗期花生生長的影響。結(jié)果表明：LX-J1抑制白絹病菌菌絲生長，共培養(yǎng)第4d的抑菌率為75.6%；培養(yǎng)30d時，LX-J1菌肥處理菌核數(shù)量比對照減少了63.7%，恒重降低了60.2%；LX-J1及其菌肥300倍稀釋處理基質(zhì)對花生出苗和前期生長具有良好促生作用，出苗比對照分別提前2d和4d，出苗率分別提高6.1%和18.2%；LX-J1菌肥處理對花生白絹病防效優(yōu)于LX-J1，防效高達83.36%，并可促進花生植株生長，利于增產(chǎn)。

關(guān)鍵詞：解淀粉芽孢桿菌LX-J1；復(fù)合微生物肥料；花生白絹病；防效

中圖分類號：S435

文獻標識碼：A 文章編號：16749944（2017）15007304

1 引言

花生（Arachis hypogaea）又名落花生，一年生草本植物，蝶形花科，起源于南美洲。中國是世界花生種植第一大國，2015年種植面積約462萬hm2，總產(chǎn)量1680.5萬t，均占世界總產(chǎn)量的40%以上。在中國，花生是四大油料經(jīng)濟作物之一，是我國主要出口創(chuàng)匯的農(nóng)作物之一[1]。在花生栽培中，根腐病、青枯病、白絹病等花生病害嚴重制約著其產(chǎn)量和品質(zhì)[2，3]。其中白絹病在世界范圍內(nèi)廣泛分布[4]，是一種真菌性土傳病害，其無性世代病原菌為齊整小核菌（Sclerotium rolfsii Sau.），有性世代為羅氏阿太菌（Atheliarolfsii）[5，6]。該病菌寄主廣，可侵染花生、白術(shù)、辣椒、油茶和桑樹等多種草本作物或木本植物[7～9]，對花生產(chǎn)量和品質(zhì)的影響逐年加重，在高溫高濕地區(qū)尤為嚴重[10]。僅美國佐治亞州，每年花生白絹病造成當?shù)馗哌_3680萬美元的直接經(jīng)濟損失[11]。在中國，山東、河南、遼寧等花生主產(chǎn)區(qū)深受其不同程度的危害[4，12]。

通常對花生白絹病的防治以化學(xué)防控為主，但化學(xué)防治過程存在成本高、防效差、農(nóng)藥殘留等問題，缺乏科學(xué)、成套的綠色防控技術(shù)。針對白絹病通過側(cè)鏈型菌核渡過不利的環(huán)境條件等發(fā)生、傳染特點，采用生防菌抑制菌核萌發(fā)、菌絲生長及菌核產(chǎn)生，是防治花生白絹病的重要途徑[13～16]。Le等[17]分離出一株對花生白絹病具有良好拮抗作用的銅綠假單胞菌（Pseudomonas），Ganesan等[18]發(fā)現(xiàn)根際木霉（Trichoderma）對白絹病菌具有很好的拮抗作用，陸燕等[19]研究發(fā)現(xiàn)解淀粉芽孢桿菌41B-1菌株可作為防治花生白絹病的生防菌。解淀粉芽孢桿菌（Bacillus amyloliquefaciens）在代謝過程中可產(chǎn)生多種抑菌的活性物質(zhì)，是當前研究的熱點。本研究使用的菌株LX-J1是楊娜等[20]從河南駐馬店花生栽培土壤中分離得到，對多種真菌病害具有防治作用，并利用其研制出一種復(fù)合微生物肥料，實驗測試了其拮抗花生白絹病菌的效果，旨在為花生白絹病的生物防治提供科學(xué)依據(jù)。

2 材料與方法

2.1 材料

2.1.1 植物材料

花生品種為冀花4號（市購）。

2.1.2 菌株

解淀粉芽孢桿菌LX-J1（保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物菌種保藏中心，保藏號為CGMCC NO.11263）由河北省農(nóng)業(yè)生物技術(shù)工程技術(shù)研究中心分離并保存；花生白絹病菌菌株（齊整小核菌，Sclerotium rolfsii Sacc.）由河北省農(nóng)業(yè)生物技術(shù)工程技術(shù)研究中心分離并保存。

2.1.3 復(fù)合微生物肥料

解淀粉芽孢桿菌LX-J1復(fù)合微生物肥料，其登記證號為微生物肥（2015）臨字（2543）號，有效活菌數(shù)≥10億/ml，N+P2O5+K2O=20.0%，劑型：液體。

2.1.4 培養(yǎng)基

牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基、PDA 固體培養(yǎng)基，配置參考方中達的方法[21]。

2.2 方法

2.2.1 平板對峙試驗

從-80 ℃超低溫冰箱保存的LX-J1甘油管中挑取一環(huán)，劃線接種到牛肉膏蛋白胨固體培養(yǎng)基，30 ℃培養(yǎng)箱倒置培養(yǎng)20 h后，挑取平板上的單菌落，接種到牛肉膏蛋白胨液體培養(yǎng)基中，180 r/min、32 ℃搖床振蕩培養(yǎng)18 h，備用；利用打孔器（直徑=0.5 mm）在白絹病菌生長良好的平板上打孔，取菌塊接種到PDA固體平板（平板直徑= 9 cm，下同）培養(yǎng)基上，25 ℃培養(yǎng)3～4 d，備用。利用打孔器（直徑=0.5 mm）在活化的白絹病菌平拍上打孔，取菌塊接種到 PDA固體平板中央，然后在距離平板中央3.5 cm 處打孔，分別加入20 uL無菌牛肉膏蛋白胨液體培養(yǎng)基（對照）和活化的 LX-J1 （OD=1.5）菌液（處理：T-1），25℃培養(yǎng)7d內(nèi)觀察不同處理對白絹病菌菌絲生長的影響，每個處理3次重復(fù)，每個重復(fù)5個平板。在距離平板中央3.5 cm處分別涂抹20 uL無菌水（對照）和LX-J1 復(fù)合微生物肥料300倍稀釋液（處理：T-2），然后利用打孔器（直徑=0.5 mm）在活化的白絹病菌平拍上打孔，取菌塊接種到 PDA固體平板中央，25 ℃培養(yǎng)1個月后觀察不同處理對白絹病菌菌核產(chǎn)生的影響。設(shè)兩個處理組，每個處理3次重復(fù)，每個重復(fù)5個平板。

2.2.2 拮抗效果測定

菌絲生長速率的測量：用直尺測量白絹病菌菌落中心到菌絲生長邊緣的長度，即菌絲生長長度=測量值-0.25 mm；待對照白絹病菌長滿平板時，按下式計算抑菌率（拮抗效果）：菌落生長抑制率=（對照菌落凈生長半徑-處理菌落凈生長半徑）/對照菌落凈生長半徑×100%。菌核數(shù)量和干重的測定：對菌核計數(shù)，并把菌核在75 ℃烘干至恒重稱重。

2.2.3 盆栽防治試驗

試驗在領(lǐng)先生物農(nóng)業(yè)股份有限公司溫室進行。帶菌基質(zhì)為本研究中心在常規(guī)栽培基質(zhì)的基礎(chǔ)上接入了高濃度的白絹病病菌，該基質(zhì)在前期育苗中播種的花生全部感染了白絹病。試驗時帶菌基質(zhì)混勻后與不同處理的制劑混勻，裝入栽培盆，每盆裝1000 g基質(zhì)，用水量500 ml澆濕，次日播種。挑選飽滿、健壯的花生種子，用75%的酒精消毒50 s，無菌水沖洗2～3次，再在1% NaClO中浸泡5 min，無菌水沖洗4～5次，播種于栽培盆，每盆播5～6粒。試驗設(shè)3個處理：①50 mL清水（對照），②50 mL菌株LX-J1發(fā)酵液原液（處理a），③50 mL復(fù)合微生物肥料300倍稀釋液（處理b）。每個處理設(shè)3個重復(fù)，每個重復(fù)8盆。

2.2.4 調(diào)查方法

于播種后第7 d開始觀察出苗情況，主要調(diào)查出苗日期及出苗數(shù)。并于第20 d和30 d記錄出苗和發(fā)病情況，發(fā)病程度全盆調(diào)查；白絹病調(diào)查是根據(jù)分級標準對發(fā)病情況進行記錄，并計算病情指數(shù)及其防效。按程凱等[22]的方法調(diào)查菌液混合在基質(zhì)中對花生苗期生長的影響。播種后第30 d，每個處理取25株測量株高、根長、地上部鮮重、地下部鮮重。

病情分級標準：0級：植株莖基部和主根均無病斑；1級：莖基部和主根上有1～3個病斑；3級：莖基部或主根上病斑較多，病斑面積占莖和根總面積的1/4～1/2；5級：莖基部及主根上病斑多且較大，病斑面積占莖基部和根總面積的1/2～3/4；7級：莖基部或主根上病斑連片，形成燒莖現(xiàn)象，但根系并未死亡；9級：根系壞死，植株地上部萎蔫或死亡。發(fā)病率%=（染病株數(shù)/調(diào)查總株數(shù)）×100%；病情指數(shù) =[∑（各級病株數(shù)×相對級數(shù)值）]（調(diào)查總?cè)~數(shù)×9）×100；防治效果（%）= （病原菌對照病指-處理組病指）/病原菌對照病指 ×100。

2.2.5 數(shù)據(jù)分析

用SPSS18.0軟件對本試驗涉及的數(shù)據(jù)進行分析，用Excel 10作圖。

3 結(jié)果與分析

3.1 LX-J1對白絹病菌生長的影響

平板對峙7 d培養(yǎng)結(jié)果表明，解淀粉芽孢桿菌LX-J1對白絹病菌菌絲生長的抑制作用顯著（表1）。共培養(yǎng)7 d內(nèi)，添加LX-J1菌液的處理組病菌菌絲生長速度比添加培養(yǎng)液的對照組慢。共培養(yǎng)第4 d，對照組的菌絲長滿平板（菌落半徑為4.5 cm），而對照組的菌落半徑僅為1.1 cm，此時LX-J1對白絹病菌的抑菌率為75.6%。

3.2 LX-J1菌肥對白絹病菌核產(chǎn)生的影響

平板對峙30d培養(yǎng)結(jié)果表明，解淀粉芽孢桿菌LX-J1復(fù)合微生物肥料能顯著抑制白絹病菌菌核的產(chǎn)生（圖1、圖2）。由圖1可知，培養(yǎng)25d時，添加LX-J1復(fù)合微生物肥料的處理平板上菌核才產(chǎn)生菌核，晚于對照。由圖2可知，培養(yǎng)30d時，添加LX-J1復(fù)合微生物肥料的處理平板上菌核數(shù)量比對照減少63.7%，恒重比對照降低了60.2%。

3.3 LX-J1及其菌肥對花生植株生長的影響

解淀粉芽孢桿菌LX-J1及其菌肥對花生出苗的影響結(jié)果見表2。由表2可知，相對于清水對照，LX-J1及其菌肥稀釋300倍處理均可促使花生種子提早出苗，分別提前2 d和4 d，并提高花生出苗率，分別提高6.1%和18.2%。

LX-J1及其菌肥對苗期花生生長的影響結(jié)果見表3。由表3可知，花生植株生長30 d后，對照和處理b存在顯著差異（P<0.05），而對照與處理a間差異不顯著（P<0.05）。LX-J1復(fù)合微生物肥料300倍稀釋液處理可提高苗期花生株高、根長、鮮重等農(nóng)藝性狀，利用植株健壯。處理b的株高、根長、總鮮重比對照分別提高4.4 cm、1.06 cm和0.95 g。

3.4 LX-J1及其菌肥對花生白絹病的防效

解淀粉芽孢桿菌LX-J1及其菌肥對花生白絹病的防治效果見表4。由表4可知，解淀粉芽孢桿菌LX-J1及其菌肥300倍稀釋液對由花生白絹病病菌引起的病害具有良好的防控效果，差異顯著（P<0.01）。效果最好的是復(fù)合微生物肥料300倍稀釋液的處理，該處理對強致病性花生白絹病菌的防治效果高達83.36%，無死苗，而解淀粉芽孢桿菌LX-J1對花生白絹病菌的防治效果僅為58.46%，但其死苗率明顯低于對照。表明解淀粉芽孢桿菌LX-J1及其菌肥300倍稀釋液處理基質(zhì)對花生白絹病菌均有防效，而復(fù)合微生物肥料防治效果更突出。

4 結(jié)果與討論

解淀粉芽孢桿菌為革蘭氏陽性菌株，與枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）親緣關(guān)系較近，多被制成芽孢類殺菌劑、生物有機肥、復(fù)合微生物肥料等生物制劑用于防治植物病害[23～25]。解淀粉芽孢桿菌復(fù)合微生物肥料是一種新一代生物制劑，具有促生、提高作物品質(zhì)、安全性高、環(huán)境友好、不易誘導(dǎo)植物病原菌產(chǎn)生抗性等優(yōu)點，是解決化學(xué)農(nóng)藥防治過程產(chǎn)生的諸多問題的有效途徑。

基于解淀粉芽孢桿菌LX-J1，本研究開發(fā)了一種復(fù)合微生物肥料，并利用該菌肥進行基質(zhì)處理防治花生白絹病試驗，具有重要意義。研究結(jié)果表明，解淀粉芽孢桿菌LX-J1對平板培養(yǎng)的花生白絹病菌有強抑制性，抑制菌絲生長及菌核生成，進一步抑制真菌的擴散，這可能是解淀粉芽孢菌防治白絹病菌的機理之一，這與陸燕等[19]發(fā)現(xiàn)解淀粉芽孢桿菌41B-1發(fā)酵液抑制花生白絹病菌菌絲生長，降低菌核數(shù)量及重量的結(jié)果相一致。高效生防菌高度存活在根際土壤或定殖植物體內(nèi)是顯著降低病原菌數(shù)量[26]，減輕病害發(fā)生的重要原因，是防治病害的前提。本研究采用的解淀粉芽孢桿菌LX-J1分離自花生連作種植田，能高效定殖在花生根系土壤及植株內(nèi)部，對白絹病菌具有良好防效，這與Kennedy等和Shen等研究結(jié)果相一致[27，28]。本研究發(fā)現(xiàn)LX-J1復(fù)合微生物肥料對花生白絹病具有強抑制作用，防效達83.36%，優(yōu)于單一利用LX-J1的防效。該現(xiàn)象產(chǎn)生的原因可能是復(fù)合微生物肥料促進花生生長，利于植株生長健壯，提高了作物綜合抗病性。研究結(jié)果表明，解淀粉芽孢桿菌LX-J1是防治花生白絹病菌的優(yōu)良菌株，基于其研制的菌肥防效突出，應(yīng)用前景廣闊。

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