單羧酸轉運蛋白4在癲癇患者腦組織中的表達

陸蔚天,黃 娟,許士葉,蔣徐麗,孫善全*

(1重慶醫科大學神經科學研究中心,重慶 400016;2重慶醫科大學人體解剖學教研室;3湖北民族學院科技學院解剖教研室;*通訊作者,E-mail:sunsq2151@cqmu.edu.cn)

單羧酸轉運蛋白4在癲癇患者腦組織中的表達

陸蔚天1，2,黃 娟1，2,許士葉1，2,蔣徐麗3,孫善全1，2*

(1重慶醫科大學神經科學研究中心,重慶 400016;2重慶醫科大學人體解剖學教研室;3湖北民族學院科技學院解剖教研室;*通訊作者,E-mail:sunsq2151@cqmu.edu.cn)

目的 檢測癲癇患者腦組織中單羧酸轉運蛋白4(monocarboxylate transporters 4,MCT4)的表達,以探討其在癲癇發生中的作用。 方法 收集16例顳葉癲癇患者和6例腦外傷患者清創術后顳葉腦組織作為研究對象,采用免疫組織化學和免疫印記檢測腦組織MCT4蛋白表達,并進行圖像分析和統計學處理。 結果 免疫組織化學顯示,對照組及癲癇組患者腦內均可見MCT4陽性細胞表達,IPP軟件分析顯示癲癇組腦內MCT4陽性細胞平均光密度值(0.266±0.012)高于對照組(0.230±0.023),差異具有統計學意義(P<0.05)。蛋白印記檢測顯示MCT4蛋白在癲癇患者腦內的表達水平(0.426±0.019)較對照組相比明顯增加(0.311±0.044),差異具有統計學意義(P<0.05)。 結論 癲癇患者腦組織中MCT4表達增高,提示MCT4與癲癇腦內異常的能量代謝密切相關。

單羧酸轉運蛋白4; 癲癇; 乳酸; 能量代謝

癲癇是一種嚴重影響人類健康的神經系統疾病,以腦內神經元異常放電為主要特征,近年來發現腦內能量代謝紊亂是癲癇發生的一個重要原因[1,2]。研究發現,為適應癲癇發作時腦內高應激狀態下的能量消耗,無氧糖酵解及其代謝產物乳酸參與了為神經元提供能量底物的過程。單羧酸轉運蛋白(monocarboxylate transporter, MCT)是一類轉運乙酰乙酸、乳酸和酮體類物質的膜蛋白,在維持細胞正常pH值環境和能量代謝等方面發揮重要作用[3,4]。在中樞神經系統,MCT4位于膠質細胞膜,負責將膠質細胞產生的乳酸轉運釋放至細胞外,以供神經元攝取并利用。以往研究證實MCT及其介導的乳酸轉運是腦內能量代謝的重要組成部分。MCT表達異常將影響細胞正常的能量代謝,加速能量代謝紊亂,在腫瘤、肥胖、認知功能障礙等發生和發展過程中發揮重要作用[4-8]。有關在MCT4在癲癇腦內表達及作用的研究,目前報道較少。因此,本研究通過檢測癲癇腦組織中MCT4的表達,以探討MCT4在癲癇發生中的作用。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

收集耐藥性顳葉癲癇患者手術切除的顳葉病灶16例,樣本來源采集于第三軍醫大學新橋醫院、大坪醫院及重慶醫科大學附屬第一醫院。其中男性10例,女性6例,平均年齡(22.17±14.18)歲。病例符合以下條件:①符合癲癇發作類型分類規定;②頭顱CT或磁共振檢查排除神經系統其他疾病。對照組6例,采集于腦外傷清創患者的顳葉腦組織,病理切片證實選取腦組織結構基本正常,患者無癲癇病史及家族遺傳性病史。以上患者家屬知情并簽署知情同意書。

兔抗人MCT4一抗、鼠抗人GAPDH一抗購自Santa Cruz公司(USA),小鼠抗兔二抗、羊抗小鼠二抗購自Biorad公司(USA),DAB顯色試劑盒購自北京中杉公司。

1.2 方法

1.2.1 標本收集及保存 對患者進行標準前顳葉切除術,術中用電極檢測并確定腦電異常部位,切除并收集腦組織。標本取出后一部分置于4%多聚甲醛4 ℃固定過夜,隨后進行梯度蔗糖脫水。組織沉底后進行連續冰凍切片,片厚20 μm,晾干后-20 ℃保存備用于免疫組織化學染色。另一部分腦組織立即置于-80 ℃冰箱待用于免疫印跡檢測。

1.2.2 免疫組織化學染色檢測腦組織MCT4表達 用0.01 mol/L PBS漂洗3次,每次5 min。0.3%過氧化氫封閉10 min,滴加兔抗人MCT4一抗(1 ∶100)4 ℃孵育過夜。取出后0.01 mol/L PBS漂洗3次,每次5 min,滴加山羊抗兔二抗37 ℃孵育10 min,0.01 mol/L PBS漂洗3次,每次5 min。配制含硫酸鎳的DAB顯色。0.01 mol/L PBS終止顯色,常規脫水、透明、封片。PBS代替一抗進行染色作為陰性對照。采用Image-Pro Plus 6.0軟件進行圖像分析,測定MCT4陽性神經元的光密度值,光密度值越高,MCT4陽性表達越高。

1.2.3 免疫印跡檢測腦組織MCT4蛋白表達 將所取腦組織在冰上研磨、裂解,收集后-80 ℃備用。BCA法檢測蛋白濃度。將蛋白進行SDS-PAGE凝膠電泳,350 mA電轉56 min至PVDF膜,37 ℃封閉1 h。加入兔抗人MCT4一抗(1 ∶400)或鼠抗人GAPDH一抗(1 ∶1 000),4 ℃孵育過夜。洗膜后加入小鼠抗兔二抗(1 ∶2 000)或羊抗小鼠二抗(1 ∶1 000),37 ℃孵育2 h。0.01 mol/L PBST洗膜后加入DAB顯色。采用Quantity one軟件測定MCT4和GAPDH條帶灰度值,用MCT4/GAPDH條帶比值作為蛋白相對值。

1.3 統計學分析

2 結果

2.1 免疫組織化學染色結果

對照組和癲癇組腦內均可見MCT4棕黃色顆粒陽性表達,IPP軟件分析MCT4陽性細胞平均光密度值癲癇組高于對照組,差異具有統計學意義(0.266±0.012vs0.230±0.023，P<0.05,見圖1)。

圖1 免疫組織化學染色檢測MCT4在對照組及癲癇組腦組織中的表達 (×200)Figure 1 Expression of MCT4 in brain tissues in control group and epilepsy group by immunohistochemistry (×200)

2.2 免疫印跡結果

與對照組相比,MCT4在癲癇腦組織內的蛋白相對表達量顯著升高,差異具有統計學意義(0.426±0.019vs0.311±0.044,P<0.05,見圖2)。

圖2 免疫印跡檢測MCT4蛋白在對照組及癲癇組腦組織中的表達Figure 2 Expression of MCT4 protein in brain tissues in control group and epilepsy group by Western blot

3 討論

癲癇是一種腦內神經元高度同步化異常放電所致的中樞神經系統功能失常性疾病[9,10]。研究表明癲癇發作與腦內能量代謝異常密切相關。正常情況下,大腦依賴大量及持續的能量供應以維持各種生理活動的需要。因此,若腦內能量代謝發生障礙將對神經元,甚至大腦的正常功能帶來極大的影響。癲癇發作時大量神經元同步放電,處于異常高代謝狀態,消耗腦內大量ATP。為補充能量供應不足的應激狀態,需要腦內加速代謝以提供能量底物。由于此時腦內處于局部相對缺氧的狀態,由有氧代謝三羧酸循環途徑的供能降低[11],不能滿足能量消耗。因此,無氧糖酵解此時作為另一條重要供能途徑啟動并且增強,為神經元提供能量供應,緩解能量相對短缺[10]。

乳酸是糖酵解途徑的中間產物,傳統觀點認為葡萄糖是為神經元活動提供能量的唯一底物,乳酸是腦內能量代謝廢物,會對神經元及腦組織造成損傷。但近來研究已證實乳酸是腦內一種非常重要的能量底物[12],并且在膠質細胞與神經元之間的信息交流中發揮重要作用[13]。有研究發現,在基礎代謝狀態下,乳酸可為腦內代謝提供約10%的能量供應。而在高代謝狀態時,這一比例可提高至60%[12]。此時,神經元從胞外攝取乳酸,在乳酸脫氫酶催化下轉化成丙酮酸,后者進入三羧酸循環有氧代謝,產生大量ATP,從而維持神經元活動需要。

在腦內,膠質細胞存儲糖原并通過糖酵解產生和釋放大量乳酸[14],神經元將乳酸轉運至細胞內作為底物進行能量合成。MCT是一類跨膜蛋白,負責轉運乙酰乙酸、酮體和乳酸等物質[15]。在中樞神經系統內,MCT4位于膠質細胞膜,可以將糖酵解產生的乳酸釋放至細胞外間隙;MCT2位于神經元,負責從細胞外攝取乳酸[16]。MCT4及其介導的乳酸轉運是否與癲癇的發生發展具有相關性,目前尚未見文獻報道。

本研究采用免疫組織化學檢測,結果顯示對照組腦內和癲癇組腦內均可見MCT4陽性細胞表達。進一步的MCT4陽性細胞光密度值檢測及蛋白免疫印跡檢測結果均顯示,癲癇組患者腦內MCT4表達水平較對照組明顯升高。在腦內,MCT4主要表達于星形膠質細胞。因此,癲癇組腦內MCT4表達升高可提示膠質細胞向細胞外轉運乳酸增強,從而可以為神經元攝取乳酸進行無氧代謝提供更多的能量底物,進而參與癲癇狀態下神經元的異常放電過程。

綜上所述,本研究結果顯示癲癇患者腦內MCT4表達增高,提示MCT4及其介導的乳酸轉運與癲癇腦內神經元異常的能量代謝密切相關。深入探討MCT4及乳酸對神經元異常放電及癲癇發生的調控,將有助于進一步闡明癲癇發病機制,并有可能會成為癲癇新的治療靶點。

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Expression of MCT4 in brain tissue of epileptic patients

LU Weitian1，2,HUANG Juan1，2,XU Shiye1，2,JIANG Xuli3,SUN Shanquan1，2*

(1InstituteofNeuroscience,ChongqingMedicalUniversity,Chongqing400016,China;2DepartmentofHumanAnatomy,ChongqingMedicalUniversity;3ScienceandTechnologyCollegeofHubeiUniversityforNationalities;;*Correspondingauthor,E-mail:sunsq2151@cqmu.edu.cn)

ObjectiveTo investigate the expression of monocarboxylate transporters 4(MCT4) protein in the brain tissues of patients with epilepsy.MethodsSixteen epileptic patients(epileptic group) and six normal temporal samples(control group) from patients undergoing surgical debridement due to head trauma were randomly selected. Immunohistochemistry and Western blot were used to detect the expression of MCT4 protein in temporal lobe.ResultsImmunohistochemistry results showed that MCT4 expressed both in control group and epileptic group, and the mean density(OD) of MCT4 immunoreactivity in epileptic group was significantly higher than that in control group(0.266±0.012vs0.230±0.023,P<0.05). Western blot showed that MCT4 expression level was significantly higher in epileptic group than that in control group(0.426±0.019vs0.311±0.044,P<0.05).ConclusionThe expression of MCT4 is up-regulated in the brain tissues of epileptic patients, which indicates that the increased expression of MCT4 in brain tissue may be involved in the pathophysiology of energy metabolism in brain tissues of patients with epilepsy.

monocarboxylate 4; epilepsy; lactate; energy metabolism

重慶市渝中區科技計劃基金資助項目(20140115);國家自然科學基金資助項目(81601051);重慶市基礎與前沿研究計劃項目(cstc2016jcyjA0172);重慶市教委科學技術研究項目(KJ1600222);重慶醫科大學2015年度國家自然科學基金預研資助項目(NSFYY201525)

陸蔚天,男,1979-05生,博士,副教授,E-mail:weitianlu@cqmu.edu.cn

2017-04-23

R742.1

A

1007-6611(2017)08-0840-04

10.13753/j.issn.1007-6611.2017.08.018