趨化因子受體CXCR6及其配體CXCL16在非小細胞肺癌中的表達及臨床意義

吳潤華,黃衍楊,唐堅清

(1福建中醫藥大學臨床技能教學中心,福州 350122;2福建中醫藥大學附屬人民醫院呼吸科;3福建醫科大學附屬第一醫院病理科;*通訊作者,E-mail:wu_runhua@126.com)

趨化因子受體CXCR6及其配體CXCL16在非小細胞肺癌中的表達及臨床意義

吳潤華1*,黃衍楊2,唐堅清3

(1福建中醫藥大學臨床技能教學中心,福州 350122;2福建中醫藥大學附屬人民醫院呼吸科;3福建醫科大學附屬第一醫院病理科;*通訊作者,E-mail:wu_runhua@126.com)

目的 探討趨化因子受體CXCR6及其配體CXCL16在非小細胞肺癌(NSCLC)組織中的表達及臨床意義。 方法 應用免疫組織化學方法檢測51例NSCLC患者癌組織及癌旁組織中CXCR6和CXCL16的表達情況。分析CXCR6和CXCL16表達與NSCLC患者臨床病理特征及預后的關系。 結果 CXCR6在癌組織及癌旁組織中的陽性表達率分別為60.78%(31/51)和27.45%(14/51),兩者間差異有統計學意義(P<0.05);CXCL16在癌組織及癌旁組織中的陽性表達率分別為58.82%(30/51)和29.41%(15/51),兩者間差異有統計學意義(P<0.05)。NSCLC患者癌組織中CXCR6表達與患者的性別、年齡及吸煙與否無明顯關聯(均P>0.05),與腫瘤大小、病理組織類型、組織分化程度、TNM分期、是否淋巴結轉移及遠處轉移有關(均P<0.05);癌組織中CXCL16的表達與患者的性別、年齡、吸煙與否、腫瘤大小、病理組織類型、組織分化程度、TNM分期、是否淋巴結轉移及遠處轉移均無明顯關聯(均P>0.05)。COX回歸分析顯示腫瘤大小、組織分化程度、TNM分期、是否淋巴結轉移及遠處轉移和CXCR6表達情況是影響NSCLC患者預后的獨立因素(均P<0.05)。 結論 CXCR6可能參與NSCLC發生發展的惡性進程,其高表達可能提示NSCLC患者預后不良。

非小細胞肺癌; 趨化因子; 預后

支氣管肺癌作為常見的惡性腫瘤之一,其發病率和病死率始終居高不下,5年生存率僅為18%[1]。最新資料顯示2015年我國支氣管肺癌新發病例73.3萬例,其中死亡病例約61萬例,位居我國惡性腫瘤死亡率首位[2]。資料表明90%以上支氣管肺癌病理類型為非小細胞肺癌(non-small cell lung cancer, NSCLC)[3],對中晚期NSCLC患者缺乏有效的治療手段是影響NSCLC患者預后的重要原因,探討NSCLC發生發展的相關分子機制對可能的靶向治療具有重要意義。新近研究表明趨化因子受體CXCR6及其配體CXCL16可能與多種惡性腫瘤組織細胞的增殖及侵襲轉移相關[4-6]。然而CXCR6及CXCL16在NSCLC組織中的表達及臨床意義國內外鮮有報道。筆者擬對CXCR6及CXCL16在NSCLC中的表達及其與NSCLC患者臨床病理特征、預后的關系進行初步探討。

1 對象與方法

1.1 對象

選取福建中醫藥大學附屬人民醫院2009-2011年期間治療的原發性NSCLC患者51例(排除其他腫瘤并發者),所有病例收集癌組織及距離癌組織3 cm以上的癌旁組織。所有患者術前或者收集標本前均未進行化療、放療及免疫治療,術后或者無法手術者均根據指南進行相應的輔助治療。其生存期從手術之日開始計算,終止日期為死亡日期或者末次隨訪日期,截止日期為2016年12月31日。所有病例均經病理組織學確診為原發性NSCLC,均有完整的病例資料。本研究通過醫院倫理委員會審查,所有患者均知情同意。

1.2 方法

1.2.1 主要試劑 鼠抗人CXCR6、CXCL16單克隆抗體購自Abcam公司,Elivision試劑盒、胃蛋白酶、H2O2及內源性生物素阻斷試劑盒均購自福州邁新生物技術公司。

1.2.2 免疫組織化學檢測 所有組織標本均經10%甲醛溶液固定,石蠟包埋,4 μm連續切片,采用免疫組織化學Elivision法染色,嚴格按照試劑盒說明方法操作。石蠟切片脫蠟水化,高壓鍋法進行抗原修復,3% H2O2孵育,生物素阻斷劑阻斷,分別加入一抗CXCR6、CXCL16單克隆抗體,工作液稀釋比例均為1 ∶100,再加入二抗反應,DAB顯色,脫水,透明,封固。用已知的陽性切片作陽性對照,用PBS代替一抗作為陰性對照。

1.2.3 免疫組織化學結果判定 兩位病理科醫師顯微鏡下獨立觀察,隨機采集10個具有代表性的視野,根據染色陽性腫瘤細胞比例及染色強度進行評分。染色陽性細胞評分標準:0分,≤10%;1分,11%-30%;2分,31%-50%;3分,≥50%。染色強度評分標準:0分,無染色;1分,弱表達染色;2分,中度表達染色;3分,強表達染色。二者相加≥4分為該基因表達陽性。

1.3 統計學方法

運用SPSS 22.0軟件進行統計分析。其中CXCR6、CXCL16蛋白表達與NSCLC患者臨床病理特征的關系采用χ2檢驗,總體生存率采用Kaplan-Meier法分析,不同因素生存率的差異采用Log Rank檢驗,多因素COX比例風險回歸分析綜合評價各因素對患者預后生存的影響。P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 CXCR6和CXCL16蛋白在NSCLC癌組織及癌旁組織中的表達情況

免疫組織化學染色結果顯示CXCR6蛋白在NSCLC癌組織中呈強陽性表達,主要陽性定位于細胞質及細胞膜上,而癌旁組織中僅于肺泡上皮細胞及漿細胞中少量表達(見圖1);CXCR6蛋白在癌組織及癌旁組織中的陽性表達率分別為60.78%(31/51)和27.45%(14/51),差異具有統計學意義(P<0.001,見表1)。

表1 NSCLC癌組織及癌旁組織CXCR6、CXCL16的表達

Table 1 The CXCR6/CXCL16 expression in NSCLC cancer tissues and adjacent non-tumor tissues

組別nCXCR6CXCL16陰性陽性χ2P陰性陽性χ2P癌組織51203117.520.00021308.940.000癌旁組織5137143615

A.癌組織中CXCR6呈強陽性表達B.癌旁組織CXCR6僅散在弱表達于肺泡上皮細胞、漿細胞中圖1 CXCR6在癌組織及癌旁組織中的表達(DAB,×400)Figure 1 Expression of CXCR6 in cancer tissues and adjacent non-tumor tissues (DAB,×400)

免疫組織化學染色結果顯示CXCL16蛋白在NSCLC癌組織中呈強-中等強度陽性表達,主要陽性定位于細胞質及細胞膜上,而癌旁組織中僅于肺泡上皮細胞及漿細胞中少量表達(見圖2);CXCL16蛋白在癌組織及癌旁組織中的陽性表達率分別為58.82%(30/51)和29.41%(15/51),差異具有統計學意義(P<0.05,見表1)。

A.癌組織中CXCL16呈強-中等強度陽性表達B.癌旁組織CXCL16僅散在弱表達于肺泡上皮細胞、漿細胞中圖2 CXCL16在癌組織及癌旁組織中的表達(DAB,×400)Figure 2 Expression of CXCL16 in the cancer tissue and adjacent non-tumor tissue (DAB,×400)

2.2 CXCR6、CXCL16的表達與NSCLC患者臨床病理特征的關系

NSCLC患者癌組織中CXCR6的表達與患者的性別、年齡、吸煙與否無明顯關聯(均P>0.05),而與NSCLC患者腫瘤大小、病理組織類型、組織分化程度、TNM分期、是否淋巴結及遠處轉移有關(均P<0.05,見表2)。CXCL16在癌組織的表達與患者的性別、年齡、吸煙與否、腫瘤大小、病理組織類型、組織分化程度、TNM分期、是否淋巴結及遠處轉移均無明顯關聯(均P>0.05,見表2)。

2.3 NSCLC患者總體生存期情況

隨訪時間為3-69個月,平均隨訪時間為35.37個月。Kaplan-Meier法分析隨訪資料，中位生存時間為33個月,3年和5年的總生存率分別為47.06%和25.49%。

2.4 NSCLC患者生存因素的單因素分析

Log-Rank檢驗結果顯示，癌組織CXCR6表達、腫瘤大小、病理組織類型、組織分化程度、TNM分期、是否淋巴結轉移及遠處轉移均可影響NSCLC患者的生存期(均P<0.05);而CXCL16表達則與NSCLC患者生存期無明顯關聯(P>0.05,見表3)。

2.5 影響預后的COX風險模型多因素分析

對可能影響NSCLC患者預后的相關因素:CXCR6表達、腫瘤大小、病理組織類型、組織分化程度、TNM分期、是否淋巴結轉移及遠處轉移等進行多因素COX風險模型分析,結果提示CXCR6表達、腫瘤大小、組織分化程度、TNM分期、是否淋巴結及遠處轉移均是影響NSCLC患者預后的獨立危險因素(均P<0.05,見表4)。

表2 CXCR6、CXCL16的表達與NSCLC患者臨床病理特征的關系 (例)

Table 2 Correlation between CXCR6/CXCL16 expression and clinicopathological features of patients with NSCLC (cases)

臨床病理特征nCXCR6CXCL16陰性陽性χ2P陰性陽性χ2P年齡0.1990.6560.6120.434 <60歲219121011 ≥60歲3011191119性別0.0480.8270.1370.714 男4016241723 女114747吸煙1.1380.2860.1300.718 是3512231520 否1688610病理組織類型18.2210.0001.3990.237 腺癌294251415 鱗癌22166715組織分化程度6.4140.0110.2910.580 低221391012 中-高297221118腫瘤大小5.9630.0150.1940.660 ≤3cm20128911 >3cm318231219TNM分期6.0920.0140.1430.710 Ⅰ-Ⅱ期3016141317 Ⅲ-Ⅳ期21417813淋巴結轉移5.2620.0220.0740.790 是287211216 否231310914遠處轉移4.4510.0351.8200.180 是101964 否4119221526

表3 NSCLC患者生存因素的單因素分析

Table 3 Univariate analysis of survival factors in NSCLC patients

臨床病理特征n生存率(%)3年5年χ2P年齡 <60歲 ≥60歲性別 男 女吸煙 是 否病理組織類型 腺癌 鱗癌組織分化程度 低 中-高腫瘤大小 ≤3cm >3cmTNM分期 Ⅰ-Ⅱ期 Ⅲ-Ⅳ期淋巴結轉移 是 否遠處轉移 是 否CXCR6 陰性 陽性CXCL16 陰性 陽性2130401135162922222920313021282310412031213075.261.061.262.360.266.851.471.835.276.574.345.479.731.229.786.50 72.073.447.273.951.232.622.334.920.832.433.411.757.00 50.561.77.649.70 19.857.30 44.860.613.247.027.30.740.391.315.1113.8517.2319.5612.0220.157.41 1.2510.4570.5320.2510.0240.0000.0000.0000.0010.0000.0060.323

3 討論

臨床資料顯示多數NSCLC患者就診時已到中晚期[1],且已出現轉移,而對于中晚期NSCLC患者缺乏有效的治療手段是影響其預后的根本原因。趨化因子受體及其配體在惡性腫瘤中的作用為我們研究NSCLC的侵襲轉移的相關機制及可能的靶向治療帶來希望。趨化因子受體是一類具有跨膜結構的G蛋白偶聯受體,包含有CR、CCR、CXCR及CX3CR等亞家族,通過與其相應配體結合介導炎性細胞因子的遷移黏附而參與眾多疾病的病理生理過程。既往對趨化因子受體及其配體的研究多集中于風濕免疫、動脈粥樣硬化等免疫炎癥相關性疾病,而越來越多的研究表明趨化因子受體家族及其相應配體可能在各系統惡性腫瘤的發生發展中起著重要作用[7-9]。

表4 NSCLC患者生存因素的多因素COX分析

Table 4 Multivariate COX analysis of survival factors in NSCLC patients

臨床病理特征 n生存率(%)3年5年HR(95%CI)P病理組織類型 腺癌 鱗癌組織分化程度 低 中-高腫瘤大小 ≤3cm >3cmTNM分期 Ⅰ-Ⅱ期 Ⅲ-Ⅳ期淋巴結轉移 是 否遠處轉移 是 否CXCR6 陰性 陽性292222292031302128231041203151.471.835.276.574.345.479.731.229.786.50 72.073.447.211.757.00 50.561.77.649.70 19.857.30 44.860.613.21.631(0.603-4.406)0.329(0.117-0.925)5.855(2.120-16.171)4.952(1.212-20.226)3.490(1.282-9.499)20.15(1.279-31.782)2.363(1.018-5.482)0.3350.0350.0010.0260.0140.0240.045

近年來,作為新近發現的趨化因子受體CXCR6及其配體CXCL16在肺癌組織中的表達及作用備受關注。Mir等[10]用免疫組織化學檢測了78份NSCLC組織標本(其中腺癌54份,鱗癌24份),發現CXCR6在NSCLC組織中高度表達,而腺癌組織中的表達顯著高于鱗癌組織。國內胡衛東等[11，12]的系列研究證實人肺癌組織細胞及肺癌細胞株均高表達CXCR6及CXCL16,體外細胞實驗證實CXCR6及CXCL16均可促進肺癌細胞株增殖活力及細胞株的遷移侵襲,而通過干擾RNA(siRNA)下調肺癌細胞株中CXCR6的表達或者CXCL16中和抗體均可抑制體外肺癌細胞株增殖力及遷移侵襲能力,提示CXCR6/CXCL16可能在肺癌的侵襲轉移中起著關鍵作用。

本研究結果提示CXCR6在NSCLC癌組織中的表達顯著高于癌旁組織,與文獻[12-15]報道一致,提示CXCR6的表達可能與NSCLC的發生存在一定的關系;另外,本研究還發現CXCR6在NSCLC癌組織中的表達與NSCLC的腫瘤大小、病理組織學類型、組織分化程度、TNM分期、是否淋巴結及遠處轉移相關。CXCR6在腺癌中的高表達可能與腺癌更易于發生局部浸潤血行轉移相關,提示CXCR6可能參與NSCLC的侵襲轉移的分子機制。Singh等[4]的研究提示CXCR6及CXCL16可能通過介導基質金屬蛋白酶(metalloproteinases, MMPs)表達增加及細胞骨架重組的方式而促進前列腺癌細胞株的侵襲轉移。Xiao等[5]研究證實CXCR6通過激活細胞外調節蛋白激酶(extracellular regulated protein kinases, ERK)ERK1/2信號通路而促進體外乳腺癌細胞株的遷移侵襲,而通過干擾RNA(siRNA)下調乳腺癌細胞株中CXCR6的表達后可明顯抑制體外乳腺癌細胞株的遷移侵襲能力。程浩等[13]研究報道CXCR6在乳腺癌細胞株中的表達水平與細胞的侵襲性相關,干擾RNA干預CXCR6沉默后,血管內皮生長因子(vascular endothelial growth factor, VEGF)表達下調,同時乳腺癌細胞株增殖侵襲能力相應下降,提示CXCR6表達介導乳腺癌細胞株的惡性生物學行為作用可能與其調控腫瘤細胞血管生成有關。Mir等[10]的細胞實驗表明CXCR6可能介導MMPs表達增加而增強NSCLC細胞株的增殖及侵襲遷移能力。然而究竟CXCR6的表達是否通過上述的機制介導NSCLC侵襲轉移的過程仍待今后進一步的研究。

趨化因子配體CXCL16是目前發現的唯一的CXCR6的配體,其蛋白分子結構獨特,具有跨膜型(trans-membrane CXCL16, TM-CXCL16)和可溶性型(soluble CXCL16, sCXCL16)兩種存在形式,而這兩種不同存在形式的配體在腫瘤細胞中的作用可能也不盡相同。Gooden等[14]的研究發現卵巢癌患者治療前的血清sCXCL16高水平與患者預后差相關,血清sCXCL16水平可作為卵巢癌患者預后的獨立危險因素。結直腸癌研究中,Kohei等[15]發現結直腸癌患者血清sCXCL16的表達顯著增加,并且血清sCXCL16水平與患者的肝轉移及預后差相關;而Kee等[16]的研究表明了結直腸癌細胞CXCL16表達增加從而促進腫瘤壞死因子-α介導的細胞凋亡而起到抑制結直腸癌肝轉移的作用。Hald等[17]檢測了NSCLC患者組織標本中的CXCR6及CXCL16表達情況,發現患者術后的病理組織類型、組織分化程度、TNM分期、是否血管浸潤及淋巴結轉移與患者預后差相關,但NSCLC組織基質細胞中CXCL16的高表達卻預示患者更好的預后。本研究結果提示CXCL16在NSCLC患者癌組織中的表達要高于癌旁組織,然而CXCL16在的癌組織的表達卻與患者腫瘤大小、病理組織類型、組織分化程度、TNM分期、是否淋巴結及遠處轉移均無明顯相關。因此,闡明CXCL16在NSCLC中的作用可能還需要從其不同的分子結構形式進行研究分析。另外,究竟血清sCXCL16水平與癌組織中CXCL16的表達存在怎樣的關系還需要今后的進一步研究。

本研究通過Kaplan-Meier法分析發現,CXCR6表達陽性的NSCLC患者生存率顯著低于CXCR6表達陰性者,提示CXCR6高表達可能與患者預后差相關;而與Hald等[17]研究結果不同的是,CXCL16的表達卻與NSCLC患者生存期無明顯相關性。多因素COX風險模型分析顯示腫瘤大小、組織分化程度、TNM分期、是否淋巴結及遠處轉移[17]及CXCR6的表達均是NSCLC患者的獨立危險因素。

綜上所述,本研究提示CXCR6可能參與了NSCLC發生發展的惡性過程,其高表達可能提示NSCLC患者預后不良,但CXCR6的表達能否作為一個早期檢測診斷的標記及其在NSCLC發生發展中的具體的分子機制仍有待將來進一步研究。

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Expression of CXCR6 and CXCL16 in non-small cell lung cancer and its clinical significance

WU Runhua1*,HUANG Yanyang2,TANG Jianqing3

(1TeachingCenterforClinicalSkill,FujianUniversityofTraditionalChineseMedicine,Fuzhou350122,China;2DepartmentofPulmonaryMedicine,People’sHospitalAffiliatedtoFujianUniversityofTraditionalChineseMedicine;3DepartmentofPathology,FirstAffiliatedHospitalofFujianMedicalUniversity;*Correspondingauthor,E-mail:wu_runhua@126.com)

ObjectiveTo investigate the expression of CXCR6 and CXCL16 in non-small cell lung cancer(NSCLC) tissues, and analyze their clinical significance.MethodsThe expression of CXCR6 and CXCL16 proteins in tumor tissues and adjacent non-tumor tissues from 51 NSCLC patients was detected by immunohistochemistry. The relationships of CXCR6 and CXCL16 expression in tumor tissues with clinicopathological features and prognosis were analyzed.ResultsThe positive expression rates of CXCR6 protein in tumor tissues and adjacent non-tumor tissues were 60.78%(31/51)and 27.45%(14/51),respectively, and the difference was significant(P<0.05). The positive expression rates of CXCL16 protein in tumor tissues and adjacent non-tumor tissues were 58.82%(30/51)and 29.41%(15/51), respectively, and there was significant difference(P<0.05). The expression rate of CXCR6 was significantly associated with tumor size, histological classification, differentiation, TNM stage, lymph node metastasis and distant metastasis(P<0.05). The expression rate of CXCL16 was not significantly correlated with tumor size, histological classification, differentiation, TNM stage, lymph node metastasis and distant metastasis(P>0.05). The tumor size, differentiation, TNM stage, lymph node metastasis,distant metastasis and CXCR6 expression were independent predictors of prognosis of NSCLC(P<0.05).ConclusionCXCR6 may be involved in the development of NSCLC malignant process, and its high expression may indicate poor prognosis in patients with NSCLC.

non-small cell lung cancer; chemokine; prognosis

吳潤華,女,1977-06生,博士,講師,E-mail:wu_runhua@126.com

2017-04-12

R734.2

A

1007-6611(2017)08-0830-06

10.13753/j.issn.1007-6611.2017.08.016