先天性巨結腸癥SEMA3C/3D基因突變抑制腸神經嵴細胞的分化和成熟

姜 茜,蔚開慧,張 震,李 頎,肖 萍,蘇 琳,李 龍,潘尚領

(1首都兒科研究所遺傳研究室,兒童發育營養組學北京市重點實驗室,北京 100020;2廣西醫科大學基礎醫學院病理生理學教研室;3首都兒科研究所附屬兒童醫院普通外科;4首都兒科研究所附屬兒童醫院病理科;5安徽醫科大學;*通訊作者,E-mail:teaco@126.com)

先天性巨結腸癥SEMA3C/3D基因突變抑制腸神經嵴細胞的分化和成熟

姜 茜1*,蔚開慧2,張 震3,李 頎3,肖 萍4,蘇 琳5,李 龍3,潘尚領2

(1首都兒科研究所遺傳研究室,兒童發育營養組學北京市重點實驗室,北京 100020;2廣西醫科大學基礎醫學院病理生理學教研室;3首都兒科研究所附屬兒童醫院普通外科;4首都兒科研究所附屬兒童醫院病理科;5安徽醫科大學;*通訊作者,E-mail:teaco@126.com)

目的 觀察先天性巨結腸癥(hirschsprung disease, HSCR)患者攜帶的SEMA3C/3D基因錯義突變編碼蛋白對原代培養的腸神經嵴細胞(enteric neural crest cell, ENCC)分化、成熟和遷移的影響。 方法 分別用野生型(wild type, WT)和突變型SEMA3C/3D質粒瞬時轉染HEK293T細胞獲取上清液,用含0.5 nmol/ml相應蛋白的上清液處理ENCC 72 h,分別用神經元、膠質細胞和未成熟神經元特異性標志物(Peripherin、GFAP、MASH1)多重免疫熒光染色法檢測處理后細胞的分化傾向和分化后神經元的成熟速度,用Transwell遷移實驗檢測細胞遷移能力的變化。 結果 與WT相比,突變型SEMA3C(S329G、V337M)處理組的ENCC分化為神經元和成熟神經元的能力均下降(WT, S329G, V337M組的Peripherin/GFAP比值分別為0.95±0.34, 0.53±0.35, 0.28±0.07;Peripherin/MASH1比值分別為1.14±0.17, 0.95±0.38, 0.60±0.19),其中以V337M突變型SEMA3C處理組的下降最為明顯(P<0.01),而野生型和突變型SEMA3C/3D對神經球的遷移均沒有明顯影響。 結論 突變型SEMA3C可以抑制ENCC分化為神經元/成熟神經元,從而影響腸神經系統的正常發育,這可能為HSCR的發病機制研究提供新的線索。

先天性巨結腸癥;SEMA3C/3D; 腸神經嵴細胞; 細胞分化

先天性巨結腸(Hirschsprung disease, HSCR)是造成新生兒及嬰幼兒腸梗阻的常見原因之一,又稱腸無神經節細胞癥(congenital aganglionosis),發病率約為1/5 000,男性高于女性[1]。HSCR是一種神經嵴細胞(neural crest cell, NCC)源性疾病,患兒在胚胎發育過程中出現NCC遷移、定植、發育異常,病變腸段神經節細胞缺如伴腸道神經調節紊亂,以致病變結腸持續異常收縮而近端腸段代償性擴張,形成巨結腸[2]。目前認為HSCR是一種多基因改變導致的遺傳性先天性疾病,現已發現多種相關基因如RET、EDN3、SOX10等,但這些基因中發現的所有突變僅能解釋不足20%的患者的發病原因,高度提示其他致病基因或危險因子的存在[3]。

Semaphorins(SEMAs)家族分子是一類系統發生學上高度保守的分泌型或跨膜型糖蛋白,屬較早發現的經典的神經元軸突導向因子,廣泛分布于神經系統。其中SEMA3是唯一表達于脊椎動物的分泌型蛋白,包括7個亞型(SEMA3A-G)[4]。SEMA3主要通過調節突觸的形成、成熟以及軸突的生長、導向等來調控神經元的遷移、增殖、分化甚至凋亡[5]。有研究發現,無論是與患者自身的正常腸段相比還是與正常對照相比,HSCR患者無神經節病變腸段平滑肌層內的SEMA3A表達量都有顯著增加,說明該基因編碼的蛋白產物可能與HSCR的發病相關[6]。本課題組前期研究發現在HSCR患者篩查中發現的5個SEMA3C/3D基因錯義突變不僅影響SEMA3蛋白的表達和分泌,還可抑制Neuro-2a細胞的軸突生長和遷移[7]。本研究擬探索SEMA3C/3D基因及5個錯義突變編碼蛋白對原代培養的腸神經嵴細胞的影響作用及其機制。

1 材料與方法

1.1 細胞和質粒來源

HEK293T細胞購自中國醫學科學院基礎醫學研究所細胞資源中心。懷孕16 d的SPF級SD大鼠(品系代碼:101)購自北京維通利華實驗動物技術有限公司(生產許可證號:京ICP備15004894號-1)。N-端AP-tagged野生型小鼠Sema3c/3d表達質粒(注:小鼠與人的SEMA3C/3D基因氨基酸序列相似度CLUSTAL 2.1評分分別為97.0和92.0,幾乎完全一致)由美國約翰霍普金斯大學Aravinda Chakravarti教授饋贈。

1.2 主要試劑和儀器

DAPI(北京索萊寶科技有限公司),P75NTR(Cell Signaling,美國),Peripherin(abcam,英國),GFAP(Cell Signaling,美國),MASH1(abcam,英國),Alexa Fluor 647標記山羊抗兔IgG(abcam,英國),Alexa Fluor488標記山羊抗小鼠IgG(abcam,英國),多聚賴氨酸(Millipore,美國),Lipofectamine 2000(Invitrogen,美國),Transwell小室(Corning,美國),激光共聚焦顯微鏡(Leica,德國)。

1.3 主要液體配制

HEK293T細胞培養基DMEM(Gibco,美國)中含10% FBS(Gibco,美國)、1%雙抗(Gibco,美國)和1%谷氨酰胺(Gibco,美國);ENCC原代培養基DMEM/F12(Gibco,美國)中含36%Neurobasal(Gibco,美國)、0.02 mg/ml bFGF(Gibco,美國)、0.02 mg/ml EGF(Gibco,美國)、0.02 mg/ml IGF1(Gibco,美國)、1%B27(Gibco,美國)、0.5%N2Supplement(Gibco,美國)和1%雙抗;ENCC促分化培養基DMEM/F12中含1%雙抗和5%FBS;lysis buffer含1%Triton和10 mmol/L Tris(pH=8.0);2×SEAP含1 mmol/L MgCl2、4 mol/L二乙醇胺、4.5 mg/ml L-高精氨酸鹽酸鹽、1 mg/ml BSA和8.9 mg/ml PNPP。

1.4 SEMA3-AP融合蛋白的獲取

將HEK293T細胞傳代于預先用0.1 mg/ml多聚賴氨酸包被的10 cm培養皿中。待細胞匯合度接近70%時,取8 μg質粒DNA(已構建好的野生型及突變型全長cDNA表達質粒)與24 μl Lipofectamine 2000分別溶于400 μl opti-MEM液中室溫靜置5 min,把對應的質粒和Lipofectamine 2000混勻(共800 μl),再室溫靜置20 min,最后將混合液均勻滴入HEK293T無雙抗細胞培養基中并于5% CO2、37 ℃培養12 h,將細胞培養液換為低血清的opti-MEM再培養72 h收集含有SEMA3C/3D-AP融合蛋白的細胞上清液,4 ℃保存備用。

1.5 SEMA3-AP融合蛋白定量檢測

將含有SEMA3C/3D-AP融合蛋白的細胞上清液用lysis buffer稀釋25倍至50 μl,再與預先加至96孔板中的50 μl 2×SEAP混合(避光),迅速移至多功能酶標儀,將機器設置為每15 s讀取一次數據,讀取5次(OD1,OD2,OD3,OD4,OD5),讀取波長405 nm。按以下公式計算Sema3-AP融合蛋白濃度:SEMA3-AP融合蛋白濃度(nmol/ml)=(OD5-OD1)×50/3.5

1.6 ENCC原代培養及性質鑒定

在冰浴及無菌條件下,用10%水合氯醛腹腔注射麻醉懷孕16 d的SD大鼠,解剖大鼠取出10只胎鼠轉移到細胞間,置于超凈工作臺中含雙抗的預冷PBS溶液內,解剖胎鼠分離出腸管。收集所有腸組織,清洗2遍,用小剪刀快速剪碎,800 r/min離心3 min,留沉淀。加稀釋后的胰蛋白酶消化4 min,胎牛血清終止消化,1 000 r/min離心3 min,留沉淀。再加PBS 13 ml,用70 μm的過濾篩過濾雜質,過濾液以1 200 r/min離心4 min,留沉淀,并按照1×106個細胞/ml接種于T25培養瓶中,置于37 ℃,5% CO2培養24 h,以2/3量換液,再孵育3 d進行傳代,之后可以2-4 d一代的速度傳代,傳代2次后便不含雜質細胞。

將克隆球傳代于預先爬片并用0.1 mg/ml多聚賴氨酸包被6 h的24孔板內培養24 h,取出細胞用4%多聚甲醛、0.5% Triton X-100各處理20 min,5% BSA封閉1 h,然后用P75NTR(1 ∶500)4 ℃孵育過夜,用Alexa Fluor 647標記山羊抗兔IgG(1 ∶200)室溫孵育1 h,DAPI染核1 min,最后取出蓋玻片,封片劑封片,激光共聚焦顯微鏡下觀察并采集圖片。

1.7 細胞免疫熒光染色

將克隆球傳代于預先爬片并用0.1 mg/ml多聚賴氨酸包被6 h的24孔板內,分別加入含0.5 nm/ml野生型或突變型SEMA3C/3D-AP融合蛋白的細胞上清液孵育72 h,將培養基換為促分化培養基再孵育7 d,取出細胞進行免疫熒光染色。

先用4%多聚甲醛固定20 min,PBS洗3次,然后用0.5%Triton X-100透膜10 min,PBS洗3次,用5%BSA封閉30 min,PBS洗3遍,最后用相應一抗(Peripherin 1 ∶200,GFAP 1 ∶200,MASH1 1 ∶200)4 ℃孵育過夜,PBS洗3遍,再用相應的二抗(1 ∶200)室溫孵育1 h,PBS洗3遍。少量DAPI染核1 min,取出蓋玻片封片劑封片,在激光共聚焦顯微鏡下觀察并采集圖片,最后采用Image-Pro Plus 6.0軟件記錄Peripherin、GFAP、MASH1的熒光強度值,用Peripherin熒光強度值/GFAP熒光強度值來反映細胞分化能力,用Peripherin熒光強度值/MASH1熒光強度值來反映細胞成熟能力,實驗結果重復3次。

1.8 Transwell遷移實驗

將克隆球傳代于Transwell上室中,下室中加入含0.5 nm/ml野生型或突變型SEMA3C/3D-AP融合蛋白的細胞上清液,同時在下室中加入10% FBS、上室中加入5% FBS促進細胞的分化,5% CO2、37 ℃繼續培養60 h取出Transwell板,用棉簽擦掉小室內表面未遷移的細胞,4%多聚甲醛固定20 min,再用0.1%結晶紫染色30 min,清水漂洗,顯微鏡下觀察并拍照。實驗結果重復3次,采用Image-Pro Plus 6.0軟件進行細胞計數用于進一步數據分析。

1.9 統計學分析

2 結果

2.1 SEMA3C/3D-AP融合蛋白定量檢測

SEMA3C/3D-AP融合蛋白定量檢測結果(均數±標準差)見表1。根據測量結果將其濃度按一定比例統一稀釋為0.5 nmol/ml,存放于-80 ℃備用。

表1 HEK293T細胞上清液中SEMA3C/3D-AP融合蛋白定量檢測結果

Table 1 Quantitative detection of SEMA3C/3D-AP fusion protein in the supernatant of HEK293T cells

上清液 OD1OD5濃度(nmol/ml)lysisbuffer0.248±0.0050.248±0.007 0±0.029AP2.765±0.0043.046±0.0114.014±0.1143CWT-AP2.589±0.1672.865±0.1993.943±0.4573CS329G-AP2.915±0.0593.241±0.0674.657±0.1143CV337M-AP0.802±0.0270.869±0.0330.964±0.0933DWT-AP0.947±0.0081.029±0.0131.171±0.0573DH424Q-AP0.720±0.0120.778±0.0130.836±0.0213DV457I-AP0.929±0.0331.026±0.0401.386±0.1003DP615T-AP0.975±0.0301.079±0.0391.493±0.136

SEMA3-AP融合蛋白濃度(nmol/ml)計算公式=(OD5-OD1)×50/3.5

2.2 體外培養腸神經嵴細胞的性質鑒定

接種初期的細胞形態多樣,孵育2 d開始出現細胞團,繼續培養細胞團會逐漸增大,在連續傳代過程中雜細胞逐漸減少而克隆球逐漸純化,最終傳代2次后便不含雜質細胞,較大的克隆球可懸浮生長。對原代培養的ENCC進行性質鑒定結果見圖1,P75NTR染色陽性,表明該克隆球具有神經干細胞特性,為腸神經嵴細胞。純度大于95%,可進行下一步實驗。

2.3 細胞免疫熒光染色實驗證實突變型SEMA3C干擾ENCC分化

在0.5 nmol/ml WT和突變型SEMA3C/3D上清液作用下,Peripherin/GFAP和Peripherin/MASH1熒光標記的染色結果分別見圖2和圖3,數據分析結果見圖2C和圖3C。結果顯示,在SEMA3C處理組中,與空載體組相比,WT SEMA3C處理組的ENCC分化為神經元和成熟神經元的傾向更加明顯(P<0.01);而與WT組相比,突變型(S329G、V337M)SEMA3C處理組的ENCC分化為神經元和成熟神經元的能力均下降,其中以V337M突變型SEMA3C處理組的下降最為明顯(P<0.01)。在SEMA3D處理組中,野生型和突變型(H424Q、V457I、P615T)SEMA3D作用下的ENCC分化為神經元和成熟神經元的能力沒有統計學差異(P>0.05)。

圖1 原代培養ENCC性質鑒定Figure 1 Identification of primary passage ENCCs

A.野生型和突變型SEMA3C-AP融合蛋白作用下ENCC免疫熒光染色

B.野生型和突變型SEMA3D-AP融合蛋白作用下FENCC免疫染色與AP比較，**P<0.01；與3C WT-AP比較，#P<0.05，##P<0.01

C.統計結果

圖2 野生型和突變型SEMA3C/3D-AP融合蛋白對ENCC分化傾向的影響(GFAP:紅色，Peripherin:綠色)

Figure 2 The effect of wild-type and mutant SEMA 3C/3D-AP fusion protein on the differentiation of ENCC

2.4 Transwell實驗結果證實SEMA3C/3D對ENCC神經球的遷移無明顯影響

在0.5 nm/ml WT和突變型SEMA3C/3D上清液作用下,穿過小室基底膜下層的細胞,其中右圖為左圖中單個神經球的放大。結果顯示,對照組、野生型、突變型SEMA3C/3D各處理組中的ENCC神經球均可以穿過Transwell小室的基底膜,野生型和突變型SEMA3C/3D對ENCC神經球的遷移均沒有明顯影響(見圖4)。

A.野生型和突變型SEMA3C-AP融合蛋白作用下的ENCC免疫熒光染色

B.野生型和突變型SEMA3D-AP融合蛋白作用下的ENCC免疫熒光染色與AP比較，**P<0.01；與3C WT-AP比較，##P<0.01

C.統計結果

圖3 野生型和突變型SEMA3C/3D-AP融合蛋白對ENCC成熟度的影響(MASH1:紅色，Peripherin:綠色)

Figure 3 The effect of wild-type and mutant SEMA 3C/3D-AP fusion protein on the maturation of ENCC

右圖為左圖中單個神經球的放大圖4 野生型和突變型SEMA3C/3D-AP融合蛋白對ENCC遷移的影響作用Figure 4 The effect of wild-type and mutant SEMA3C/3D-AP fusion protein on the migration of ENCC

3 討論

SEMA3作為唯一表達于脊椎動物的分泌型神經元軸突導向因子,包括7個亞類分子(SEMA3A至3G)。SEMA3蛋白由400-1 000個氨基酸構成,含有一個免疫球蛋白樣(immunoglobulin-like)結構區、一個PSI(plexins,semaphorins and intesrins)區域和一個高度保守的SEMA結構域[8],其中S329G、V337M、H424Q和V457I突變均發生在高度保守的SEMA結構域,而P615T突變則發生在Ig結構區。由于SEMA3對于神經軸突的成束、分枝、導向、突觸形成及神經元遷移、增殖、分化都具有重要調控作用,因此,當SEMA3發生突變時,很可能通過影響蛋白的結構和功能引起相關疾病的發生[9]。

本研究首次以離體培養的腸神經嵴細胞為對象研究先天性巨結腸患者攜帶的SEMA3C/3D基因錯義突變編碼蛋白的功能變化及其作用機制。本試驗首先參考文獻[10]建立了大鼠胚胎ENCC體外原代培養模型,由于P75NTR為分化前的神經嵴細胞的一種標志物[11],所以根據P75NTR染色陽性和細胞的生長狀態可確定該細胞為腸神經嵴細胞,這種ENCC原代培養技術的建立為腸神經系統疾病病因學研究提供了極大的便利。Peripherin和GFAP均是一種Ⅲ型中間纖維絲蛋白,參與細胞骨架系統的構成并維持一定的張力強度,其中Peripherin特異性地表達于神經元內,而GFAP特異性地表達于星型膠質細胞中[12]。MASH1為哺乳動物早期神經分化發育的關鍵基因,多表達于神經元分化之前,并隨著細胞分化的進程表達量逐漸降低。因此,本研究應用神經元和膠質細胞(Peripherin、GFAP)特異性標志物多重免疫熒光染色法檢測ENCC的分化傾向(Peripherin熒光強度值/GFAP熒光強度值);應用不同成熟期神經元(Peripherin、MASH1)特異性標志物多重免疫熒光染色法檢測ENCC分化后神經元的成熟速度(Peripherin熒光強度值/MASH1熒光強度值)。

有研究表明SEMA3在不同的組織結構或發育期可表現為2種效應:促進作用和抑制作用[13,14]。SEMA3A對皮質神經軸[15]以及SEMA3E對視網膜神經細胞[16]均表現為抑制作用,但是SEMA3A對膽堿能神經元[17]以及SEMA3E對小鼠海馬鉤回神經元軸突的生長[18]卻均表現為促進作用,Mumblat等[19]的研究發現SEMA3C對淋巴內皮細胞表現為抑制作用,可以誘導其細胞骨架塌陷。本研究的多重免疫熒光染色結果顯示,野生型SEMA3C可以促進ENCC更多的往神經元的方向分化,并有促進其成熟的作用,而突變型SEMA3C的上述作用較之野生型都明顯減弱。與SEMA3C相比,SEMA3D的作用不明顯。Transwell實驗結果顯示,野生型和突變型SEMA3C/3D對ENCC神經球的遷移均沒有明顯的影響。因此,本研究結果提示SEMA3C可以通過促進ENCC的分化和成熟(而非遷移)促進腸神經系統的正常發育,而當SEMA3C發生突變、蛋白質功能嚴重受損時,ENCC則不能正常分化和成熟,繼而引起HSCR的發生。至于SEMA3D突變蛋白的作用機制可能還需要進行進一步的深入研究。

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SEMA3C/3Dmutations in Hirschsprung disease patients inhibit the differentiation and maturation of enteric neural crest cells

JIANG Qian1*,YU Kaihui2,ZHANG Zhen3,LI Qi3,XIAO Ping4,SU Lin5,LI Long3,PAN Shangling2

(1DepartmentofMedicalGenetics,BeijingMunicipalKeyLaboratoryofChildDevelopmentandNutriomics,CapitalInstituteofPediatrics,Beijing100020,China;2DepartmentofPathophysiology,SchoolofPreclinicalSciences,GuangxiMedicalUniversity;3DepartmentofGeneralSurgery,Children’sHospitalAffiliatedtoCapitalInstituteofPediatrics;4DepartmentofPathology,Children’sHospitalAffiliatedtoCapitalInstituteofPediatrics;5AnhuiMedicalUniversity;*Correspondingauthor,E-mail:teaco@126.com)

ObjectiveTo explore the effect ofSEMA3C/3Dmutations in Hirschsprung disease patients on the differentiation, maturation and migration of the enteric neural crest cells(ENCC).MethodsHEK293T cells were transfected with wild-type(WT) and mutant SEMA3C/3D-AP plasmids to collect the fusion protein supernatant. The ENCCs were treated with wild-type and mutant supernatants containing 0.5 nmol/ml of corresponding fusion protein for 72 h. Differentiation, maturation and migration abilities of the ENCC were determined by multiple-immunofluorescence(Peripherin, GFAP, MASH1) and Transwell migration assay.ResultsCompared with WT group, the ability of ENCC to differentiate into neurons/mature neurons both decreased in mutant SEMA 3C groups, especially in V337M SEMA 3C group(P<0.01). The Peripherin/GFAP ratios of WT, S329G and V337M were 0.95±0.34, 0.53±0.35 and 0.28±0.07, respectively;and the Peripherin/MASH1 ratios of WT, S329G and V337M were 1.14±0.17, 0.95±0.38 and 0.60±0.19, respectively. There was no statistically significant difference in migration capacity of ENCC between WT group and mutant SEMA3C/3D group.ConclusionMutant SEMA3C may affect the development of the enteric nervous system by inhibiting the ENCC to differentiate into neurons/mature neurons, which may provide a new clue for the pathogenesis of HSCR.

Hirschsprung disease;SEMA3C/3D; enteric neural crest cell; cell differentiation

國家自然科學基金青年科學基金資助項目(81300266);北京市自然科學基金面上項目(7142029);北京市優秀人才培養個人項目(2013D003034000007);北京市科技新星基金資助項目(Z151100000315091)

姜茜,女,1979-10生,博士,副研究員,E-mail:teaco@126.com

2017-05-08

R725.7

A

1007-6611(2017)08-0817-06

10.13753/j.issn.1007-6611.2017.08.013