人巨細胞病毒微小RNA miR-US4-5p靶向抑制PAK2的表達

邵耀中,齊 瑩,郭 鑫,蔣樹娟,黃郁晶,柳中洋,阮 強,解立怡

(西安交通大學第一附屬醫院腎臟內科,陜西 西安 710061;*通訊作者,E-mail:275573101@qq.com)

人巨細胞病毒微小RNA miR-US4-5p靶向抑制PAK2的表達

邵耀中,齊 瑩,郭 鑫,蔣樹娟,黃郁晶,柳中洋,阮 強,解立怡*

(西安交通大學第一附屬醫院腎臟內科,陜西 西安 710061;*通訊作者,E-mail:275573101@qq.com)

目的 尋找人巨細胞病毒微小RNA miR-US4-5p調控的靶mRNA,檢測miR-US4-5p對靶mRNA PAK2蛋白質表達的調節作用。 方法 采用Hybrid-PCR方法及Targetscan軟件分析從人巨細胞病毒感染的人胚肺成纖維細胞總RNA中篩選候選靶mRNA;應用熒光素酶實驗,通過構建PMIR-PAK2報告基因,將其和miR-US4-5p、miRNA陰性對照共轉染到HEK293細胞中,驗證miR-US4-5p與候選靶mRNA的結合能力;應用Western blot方法,通過將miR-US4-5p、miRNA陰性對照分別轉染到HEK293細胞、HELF細胞、THP-1細胞中,驗證轉染miR-US4-5p對靶mRNA蛋白質表達的調節作用。 結果 通過Hybrid-PCR方法及Targetscan篩選出12個miR-US4-5p的待選靶mRNA;熒光素酶實驗表明:與轉染miRNA陰性對照相比,轉染miR-US4-5p可以顯著地下調PMIR-PAK2的熒光素酶活性,從而驗證了miR-US4-5p與PAK2的結合性,在HEK293細胞、HELF、THP-1細胞中PAK2可以被過表達的miR-US4-5p造成不同程度的下調。 結論 人巨細胞病毒表達的miR-US4-5p在三種不同細胞系中具備抑制PAK2蛋白質表達的能力。

人巨細胞病毒; 微小RNAs; p21激活激酶

人巨細胞病毒(human cytomegalovirus,HCMV)是一種普遍存在的β-皰疹病毒。在免疫力低下的患者中,有較高的發病率和死亡率[1]。人巨細胞病毒具有230 kb的基因組,編碼來自16個前體的至少26個成熟miRNA[2]。miRNA對它們靶mRNA的轉錄后調控被認為是通過miRNA 5′末端的2-7個核苷酸(被稱為種子區)和位于mRNA 3′非編碼區的結合位點之間的結合來實現。這種結合導致所涉及的靶mRNA的翻譯抑制和降解[3]。越來越多的證據表明,病毒的miRNA可與免疫逃避、潛伏感染及細胞凋亡相關[4-6]。作為一個從人巨細胞病毒miR-US4前體來源的miRNA,人巨細胞病毒的miR-US4-5p是從HCMV感染的人胚肺成纖維細胞(HELF)小RNA的深度測序分析中首次鑒定的[7]。然而,它的功能目前還不清楚。

因此,基于miRNA在病毒和宿主生物學功能中所發揮的巨大作用,本研究通過Hybrid-PCR的方法篩選人巨細胞病毒miR-US4-5p的待選靶基因,通過熒光素酶試驗對待選靶基因進一步驗證,并應用Western blot的方法在多種細胞系中驗證miR-US4-5p對待選靶基因蛋白表達的影響。這對進一步研究miR-US4-5p對宿主疾病發生的機制、探究其生物學功能均具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 病毒株、細胞株

實驗所用的HCMV Han株是本實驗室保存的臨床分離株。人胚肺成纖維細胞(HELF)、人胚腎293細胞(HEK293)、人外周血單核細胞THP-1來自于中國科學院上海細胞所。

1.2 感受態細菌、質粒、抗體

Top10感受態細菌購自北京天根生化科技有限公司;使用含15%胎牛血清的MEM培養HELF。使用含10%胎牛血清的DMEM培養HEK293細胞。使用含10%胎牛血清的1640培養THP-1細胞。PCR2.1載體購自Invitrogen公司(美國);熒光素酶報告質粒購自Applied Biosystems公司(美國);熒光素酶活性檢測試劑購自Promega公司(美國);蛋白質提取和檢測試劑購自Thermo公司(美國);抗體購自Abcam公司(美國);PCR試劑、限制性內切酶、T4 DNA連接酶購自TakaRa公司(中國);、miR-US4-5p的成熟體、抑制劑及陰性對照成熟體購自RiboBio公司(中國)。

1.3 hybrid-PCR和Targetscan軟件預測篩選miR-US4-5p的候選靶mRNA

Hybrid PCR是快速有效篩選任意miRNA候選靶mRNA的方法[8]。Hybrid PCR基于3′-Full RACE的實驗方法,根據miRNA序列(5′-UGGACGUGCAGGGGGAUGUCUG-3′)設計miR-US4-5p的雜交引物(5′-CRGRCRTCCCCCTGCRCGTCCR-3′)。以HCMV感染細胞的晚期(L)總RNA為模板,使用miR-US4-5p的雜交引物與oligo dT的通用內外引物,進行半巢式擴增,得到候選靶基因的信息池。具體操作步驟如下:培養HELF,密度為100%時接種HCMV Han株。在接毒后72 h,用Trizol法提取HCMV感染晚期總RNA。用TaKaRa公司的3’Full RACE試劑盒中的oligo dT引物及逆轉錄酶將mRNA反轉錄成cDNA。設計并使用miR-US4-5p的雜交引物作為上游引物,oligo dT引入的通用引物“ACCGTCGTTCCACTAGTGATTT”作為下游引物,以cDNA為模板進行PCR擴增,引物由上海invitrogen公司合成。PCR產物經過純化后(A9280,Promega,美國),用TA克隆的辦法連接到PCR2.1載體(TakaRa,中國)。將連接產物轉化到感受態細菌中,隨機挑取陽性克隆進行DNA測序。測序結果經過NCBI的blast軟件比對得到同源的mRNA序列,作為待選的靶mRNA(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast)。同時也使用Targetscan(http://www.targetscan.org/)在線進行miR-US4-5p靶基因的預測。選取這兩個靶基因庫的交集。

1.4 熒光素酶實驗驗證miR-US4-5p與候選PAK2 mRNA的結合能力

用逆轉錄PCR方法擴增PAK2 mRNA與miR-US4-5p結合位點附近300-500 bp的序列。在擴增引物的5′末端分別加入了SpeⅠ和HindⅢ酶切位點序列。純化PCR產物,進行SpeⅠ和HindⅢ雙酶切。將酶切產物連接到pMIR report載體上熒光素酶基因的3′非翻譯區(3′UTR區)的相應位點,得到“pMIR-PAK2”表達載體。培養HEK293細胞,采用lip3000共轉染pMIR-PAK2、海腎熒光素酶質粒(TK)以及miR-US4-5p的成熟體(銳博公司,廣州)到HEK293細胞。每個候選靶mRNA做3個復孔。用線蟲的一種非特異性靶向miRNA作為陰性對照。用pMIR空載體作為系統誤差對照。貼壁細胞通過裂解釋放熒光素酶(Dual-Luciferase? Reporter Assay E1960,promega,美國),進行熒光素酶活性檢測(LB9507,Berthhold Technologies,德國)。先檢測每一樣本的螢火蟲熒光素酶熒光強度,后檢測海腎熒光素酶熒光強度。用“螢火蟲熒光素酶熒光值/海腎熒光素酶熒光值”得到消除了組內轉染誤差的終數據。以每個樣本的3個復孔所測終數據的平均值進行對比分析。

1.5 Western blot實驗分析miR-US4-5p對PAK2蛋白質表達的調控作用

通過Western blot實驗,分析不同細胞系中過表達miR-US4-5p對PAK2蛋白質表達是否有下調作用。將miR-US4-5p成熟體轉染至HEK293、HELF、THP-1細胞中,分為陰性對照組和轉染miR-US4-5p成熟體組。用線蟲的一種非特異性靶向miRNA成熟體作為微小RNA陰性對照,使用甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)作為組內對照消除轉染誤差。轉染24 h后收集蛋白質(M-PER?Mammalian Protein Extraction Reagent, PIERCE,美國)進行Western blot檢測。依次使用兔源多克隆抗體(Abcam公司,英國)和山羊抗兔的二抗(中杉金橋公司,北京)進行反應。使用ChemiDocTMMP System(Biorad,美國)進行成像,使用儀器配套軟件image lab進行實驗結果灰度分析處理。

2 結果

2.1 Hybrid-PCR及Targetscan篩選結果

從19個hybrid-PCR克隆中獲得了4個cDNA序列(見表1)。同時通過Targetscan (http://www.targetscan.org/)預測了9個待選靶基因(見表2)。所有靶基因均來自人基因組。PAK2是唯一同時存在于兩種預測方式中的靶基因。通過生物信息學軟件RNAhybrid (http://bibiserv.techfak.uni-bielefeld.de/rnahybrid/submission.html)繪制了miR-US4-5p與PAK2 3'-UTR方向互補示意圖,并得出最小解離自由能為-33.7 kcal/mol(見圖1)。這些靶基因涉及到細胞凋亡、HCMV感染與復制、細胞能量代謝、生物大分子合成等方面。

表1 Hybrid-PCR篩選獲得的HCMV miR-US4-5p候選靶mRNAs

Table 1 Putative targets of hcmv-miR-US4-5p identified by hybrid-PCR

mRNAnamesAccessionNo.Homosapiensmortalityfactor4like2(MORF4L2)NM-001142426HomosapiensRNAbindingprotein,fox-1homolog(C.elegans)2(RBFOX2)NM-001082577HomosapiensnuclearfactorI/X(CCAAT-bindingtranscriptionfactor)(NFIX)NM-002501Homosapiensp21protein(Cdc42/Rac)-activatedkinase2(PAK2)NM-002577

表2 Targetscan軟件預測獲得的HCMV miR-US4-5p候選靶mRNAs

Table 2 Putative targets of hcmv-miR-US4-5p predicted by Targetscan(http://www.targetscan.org/)

mRNAnamesAccessionNo.HomosapiensKCNE1-like(KCNE1L)NM-012282Homosapiensp21protein(Cdc42/Rac)-activatedkinase2(PAK2)NM-002577HomosapiensXK,Kellbloodgroupcomplexsubunit-relatedfamily,member5(XKR5)NM-001289973Homosapiensmembraneassociatedguanylatekinase,WWandPDZdomaincontaining2(MA-GI2)NM-001301128HomosapiensSp6transcriptionfactor(SP6)NM-199262Homosapienscalmodulin1(phosphorylasekinase,delta)(CALM1)NM-006888Homosapiensneuro-oncologicalventralantigen1(NOVA1)NM-002515Homosapiensproteinphosphatase3(formerly2B),regulatorysubunitB,alphaisoform(PPP3R1)NM-000945Homosapienszincfinger,BED-typecontaining4(ZBED4)NM-014838

將終止密碼子后的第一個堿基位置定義為“1”,預測的miR-US4-5p種子區與PAK2的結合位點在PAK2 3′非編碼區2240-2246的位置,其最小解離自由能為-33.7 kCal/mol圖1 PAK2 3′-UTR與miR-US4-5p結合靶位點示意圖Figure 1 A schematic diagram of predicted binding site of miR-US4-5p in the PAK2 3′UTR

2.2 熒光素酶實驗檢測結果

將PAK2 3′-UTR構建到pMIR-REPORTERTMLuciferase載體,轉染HEK293后,通過雙熒光素酶檢測系統檢測miR-US4-5p對PAK2 3′-UTR的調控作用。熒光素酶活性分析結果顯示,與miRNA的陰性對照相比較,miR-US4-5p組PAK2 3′-UTR的熒光值顯著降低(P<0.05,見圖2), miR-US4-5p可以下調構建有PAK2 3′非編碼區的PMIR質粒(PMIR-PAK2)約50%的熒光素酶活性。

與miRNA陰性對照比較，*P<0.05圖2 驗證miR-US4-5p靶向PAK2 mRNA的熒光素酶實驗檢測結果Figure 2 Result of Luciferase assay to validate miR-US4-5p targets at PAK2

2.3 從蛋白水平驗證miR-US4-5p靶向下調PAK2表達的Western blot結果

Western blot檢測了miR-US4-5p對PAK2蛋白表達水平的影響，結果發現,PAK2 siRNA有效地抑制了3種不同細胞系內源表達的PAK2蛋白表達水平。與之相似,3種不同細胞系內源表達的PAK2蛋白表達水平同時也被miR-US4-5p不同程度下調(見圖3)。

3 討論

隨著HCMV編碼的miRNA的發現[7,9-11],關于這些miRNAs的生物學功能逐漸被研究,包括miR-UL112-1[5,12-14]、miR-US25-1[14,15]、miR-US25-2-3p[16]、miR-UL36[17]、miR-UL70-3p以及miR-UL148D[2,18]。諸多證據表明,HCMV利用自身編碼的miRNAs來調節自身及宿主細胞的基因差異表達進一步完成免疫逃避、細胞進程調節、病毒DNA復制以及對細胞凋亡的調節。

PAK2即p21活化激酶,是一個廣泛存在于所有組織和細胞系中的62 kDa大小的蛋白。一些研究表明,不像PAK1,PAK2在細胞程序性凋亡,在不同的背景下發揮著雙重的作用。碳末端催化的36 kDa大小的PAK2片段(PAK2p34)是從PAK2裂解衍生/活化而來,與Fas和神經酰胺誘導的Jurkat細胞凋亡,TNF-α誘導的MCF-7細胞凋亡和紫外線誘導的A431細胞的凋亡相關[19,20],這表明裂解衍生/活化的PAK2具有促凋亡功能。除了裂解衍生/活化的PAK2p34具有的促凋亡功能,全長的PAK2具有抗凋亡功能。體外表達持續活性PAK2-T402E,其模仿活化全長PAK2,似乎消除了PAK2p34對腫瘤壞死因子α,生長因子的撤出以及紫外線對于BALB3T3成纖維細胞的促凋亡作用。其機制似乎是對促細胞凋亡Bcl-2家族蛋白Bad的磷酸化以及調節應激誘導的ERK,JNK和p38途徑[21]。此外,這種觀點被最近的觀察所支持,在用紫杉醇刺激的SKOV3-TR30細胞中過表達miR-134通過下調PAK2表達表現出了促凋亡的作用。這可能與把Bad磷酸化為Bad-112和Bad-136有關[22]。

1.negative control；2.hcmv-miR-US4-5P；與陰性對照比較，*P<0.05圖3 miR-US4-5p對三種細胞中PAK2蛋白表達的影響的免疫印跡結果Figure 3 PAK2 expression in three kinds of cells after treated with miR-US4-5p by Western blot

HCMV包含了許多抗凋亡的基因,如US28,US4,UL37,UL38和UL144[23-28]。另外,越來越多的研究表明,HCMV編碼的miRNA可以調節細胞凋亡。hcmv-miR-UL148D和hcmv-miR-UL36-5p被報道在感染細胞中有抑制凋亡的能力[18,29]。hcmv-miR-US25-1可以促進由氧化低密度脂蛋白所介導的內皮細胞的凋亡[30]。在本研究中,過表達miR-US4-5p可以下調多種細胞系中PAK2的表達,因此推測miR-US4-5p在自然感染狀態下的后期階段可以通過抑制PAK2表達發揮促凋亡作用,從而達到相應的生物學效應,例如促進病毒釋放。盡管如此,細胞凋亡受到很多因子調節,例如BAD、TRAIL、NF-κb、Bcl-2和Bax。盡管過表達miR-US4-5p表現出抑制PAK2表達,但是這個對凋亡的確切作用還需要進一步的研究?？梢约俣?在和其他的促凋亡的HCMV的基因和miRNA一起的作用下,miR-US4-5p可能在調節自然感染狀態下細胞凋亡并在感染晚期宿主細胞和病毒之間建立平衡發揮著作用。

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Human cytomegalovirus miRNA miR-US4-5p inhibits expression of PAK2

SHAO Yaozhong,QI Ying,GUO Xin,JIANG Shujuan,HUANG Yujing,LIU Zhongyang, RUAN Qiang,XIE Liyi*

(DepartmentofNephrology,FirstAffiliatedHospital,Xi’anJiaotongUniversity,Xi’an710061,China;*Correspondingauthor,E-mail:275573101@qq.com)

ObjectiveTo find the target message RNAs(mRNA) of human cytomegalovirus(HCMV) microRNA(miRNA) miR-US4-5p, and to explore the effects of miR-US4-5p on protein expression of the target mRNA PAK2.MethodsHybrid-PCR and Targetscan were used to screen the candidate target mRNAs in the pool of human embryo lung fibroblast(HELF) total RNAs. Luciferase report assay was used to validate the specific banding of miR-US4-5p to PAK2 mRNA after PMIR-PAK2 was constructed and contransfected with miR-US4-5p and miRNA negative control to HEK293 cells. Western blot was used to validate the regulation effects of miR-US4-5p on the protein expression of target mRNA after miR-US4-5p, miRNA negative control transfected to HEK293 cells, HELF cells, THP-1 cells.ResultsTwelve mRNAs, including PAK2(p21-activated Kinase 2), were identified as the targets of miR-US4-5p. Dual-luciferase assay showed the luciferase activity of PMIR-PAK2 was significantly down-regulated after transfection of miR-US4-5p compared to the miRNA negative control, which validated the binding of miR-US4-5p and PAK2. PAK2 expression was down-regulated by over-expressed miR-US4-5p in HEK293, HELF and THP-1 cells.ConclusionHCMV miR-US4-5p may have the ability to inhibit the protein expression of its target mRNA, PAK2, during infection.

human cytomegalovirus; microRNAs; PAK2

國家自然科學基金資助項目(81171580)；教育部高等學校博士學科點專項科研基金資助項目(20112104110012)

邵耀中,男,1988-05生,博士,助理研究員,E-mail:asdsaosao@163.com

2017-04-10

Q78

A

1007-6611(2017)08-0808-05

10.13753/j.issn.1007-6611.2017.08.011