OE19腫瘤干細胞的無血清分離培養(yǎng)以及腫瘤干細胞特性的鑒定

尹曉然,馮 誠,馬一楠,高曉燕,劉 欣,賈麗君,張寅斌,張 軍

(1西安交通大學醫(yī)學院第二附屬醫(yī)院腫瘤科,西安 710004;2西安交通大學醫(yī)學院第二附屬醫(yī)院消化科;*通訊作者,E-mail:yinxiaoran@163.com)

OE19腫瘤干細胞的無血清分離培養(yǎng)以及腫瘤干細胞特性的鑒定

尹曉然1*,馮 誠2,馬一楠1,高曉燕1,劉 欣2,賈麗君1,張寅斌1,張 軍2

(1西安交通大學醫(yī)學院第二附屬醫(yī)院腫瘤科,西安 710004;2西安交通大學醫(yī)學院第二附屬醫(yī)院消化科;*通訊作者,E-mail:yinxiaoran@163.com)

目的 從人Ⅱ型食管胃交界處腺癌OE19細胞中分離富集腫瘤干細胞的懸浮腫瘤細胞球,鑒定該懸浮腫瘤球細胞的腫瘤干細胞生物學特性。 方法 使用無血清培養(yǎng)法從OE19細胞株中富集得到懸浮腫瘤細胞球,并將其傳代擴增;同時常規(guī)培養(yǎng)OE19親本細胞。采用MTT實驗、單細胞克隆形成實驗、血清分化實驗以及Transwell實驗,研究OE19懸浮腫瘤球細胞與OE19親本細胞的增殖、更新、分化和侵襲能力的差異;使用real-time PCR以及Western blot法檢測兩者腫瘤干細胞標志ABCG2和CD133的表達情況;使用裸鼠成瘤實驗研究OE19懸浮腫瘤球細胞以及OE19親本細胞的體內成瘤能力。由此鑒定懸浮腫瘤球細胞的腫瘤干細胞特性。 結果 在無血清培養(yǎng)條件下,OE19細胞能夠形成懸浮腫瘤細胞球。懸浮腫瘤球細胞具有穩(wěn)定傳代的特性以及多向分化的潛能。OE19懸浮腫瘤球細胞與OE19親本細胞相比較高表達腫瘤干細胞標志ABCG2和CD133(P<0.05),其體外增殖、自我更新、克隆形成、侵襲轉移以及裸鼠體內成瘤能力均高于OE19親本細胞(P<0.05)。 結論 通過無血清非黏附培養(yǎng)法可以有效富集OE19懸浮腫瘤細胞球。該懸浮腫瘤球細胞高表達腫瘤干細胞標志分子ABCG2和CD133,具有腫瘤干細胞特性。

食管胃交界處腺癌; OE19細胞; 無血清培養(yǎng); 腫瘤干細胞; 腫瘤細胞球

20世紀80年代以來，世界范圍內的食管鱗癌和胃遠端腫瘤的發(fā)病率明顯下降，而美國白人、歐洲國家人群以及我國食管胃交界處腺癌(esophageal-gastric junction adenocarcinoma, AEG)的發(fā)病率逐年升高[1]。Siewert等[2]提出AEG起源于食管末端Z線上下5 cm區(qū)域內，是一類獨立的消化系統(tǒng)惡性腫瘤。按解剖特點將其分為三型：Ⅰ型為食管下段腺癌，腫瘤中心位于Z線上方1-5 cm區(qū)域。Ⅱ型為賁門腺癌，腫瘤中心位于Z線上1 cm至Z線下2 cm區(qū)域。Ⅲ型為賁門下胃腺癌，腫瘤中心位于Z線下2-5 cm區(qū)域。Ⅰ型和Ⅱ型AEG傾向于按照食管腺癌治療，Ⅲ型AEG則按胃癌治療[3]。AEG發(fā)病隱匿，癥狀不明顯，許多患者就診時已達晚期，錯失了最佳的手術時期。AEG預后差，術后轉移、復發(fā)率高，并對放療以及化療的敏感度欠佳，晚期患者死亡率較高[4]。因此，迫切需要尋找其他有效的治療方法以提高療效，改善患者的生存。

腫瘤干細胞(cancer stem cells,CSCs)是腫瘤組織中少數(shù)具有干細胞性質的細胞群體,約占腫瘤組織細胞總數(shù)的0.01%-2.00%[5]。CSCs具有自我更新和多向分化潛能,具有強大的侵襲能力,能夠逃脫免疫細胞的攻擊,對放化療不敏感,是腫瘤發(fā)生、發(fā)展、復發(fā)和轉移的根源[6]。因此,消除CSCs成為治療惡性腫瘤的關鍵。CSCs研究的前提是分離、鑒定CSCs。分離和富集CSCs的方法主要包括通過特定CSCs標記物、使用流式或免疫磁珠、使用無血清懸浮分選等方法[5,7]。不同的分選方法各有利弊,需要研究者根據(jù)不同腫瘤細胞的具體情況進行權衡。

本研究采用無血清非黏附培養(yǎng)法對AEG細胞株OE19進行分離和富集,對富集的懸浮腫瘤細胞球進行體內外一系列CSCs特性的鑒定,并對兩個潛在的CSCs標志分子CD133和ABCG2在OE19懸浮腫瘤細胞球的表達及其與CSCs特征之間的內在聯(lián)系進行探索;旨在建立一種快速分離AEG的CSCs的通用方法,為AEG的CSCs的深入研究提供研究基礎。

1 材料與方法

1.1 細胞株及主要試劑

人Ⅱ型AEG細胞系OE19，由第三軍醫(yī)大學房殿春教授饋贈;胎牛血清(FBS)、RPMI1640培養(yǎng)基均購自美國Gibco公司,0.25%胰酶-EDTA購自美國HyClone公司;重組人堿性成纖維生長因子(b-FGF)、重組人表皮生長因子(EGF)均購自美國PeproTech公司,B27購自美國Invitrogen公司,重組人胰島素購自美國Sigma公司;Transwell小室購自美國Corning公司,Matrigel膠購自美國BD公司;PVDF膜購自美國Millipore公司,鼠抗人Oct4和Nanog單克隆抗體購自美國Cell Signaling Technology公司,鼠抗人β-actin單克隆抗體購自美國Santa Cruz公司,鼠抗人CD133單克隆抗體購自美國Millipore公司,鼠抗人ABCG2單克隆抗體購自美國Abcam公司;四甲基偶氮唑鹽(MTT)、DMSO購自美國Sigma公司;Trizol試劑購自美國Invitrogen公司,Prime ScriptTMRT Master Mix試劑盒、SYBR Premix Ex TaqⅡ購自日本Takara公司。

1.2 無血清條件下培養(yǎng)OE19細胞獲取懸浮腫瘤細胞球

將OE19細胞接種至含10% FBS的RPMI1640中(完全培養(yǎng)基),37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱內培養(yǎng),3-4 d傳代1次,實驗取對數(shù)生長期的細胞。

將對數(shù)生長期的OE19細胞以1×104/ml的濃度接種至含20 ng/ml的EGF、10 ng/ml的bFGF、10 ng/ml的LIF、B27(體積比為1 ∶50)和2 mmol/L的L-谷氨酰胺的無血清RPMI1640培養(yǎng)液中,37 ℃、5% CO2常規(guī)培養(yǎng),隔日800 r/min離心5 min換液。每日光鏡下觀察細胞狀態(tài),觀察懸浮腫瘤細胞球形成的情況。根據(jù)懸浮腫瘤細胞球的生長情況,用0.25%胰酶將懸浮腫瘤球消化成單細胞懸液,1 000 r/min離心5 min,棄上清,進行傳代培養(yǎng)。實驗用第3代以后的懸浮腫瘤細胞球。

另外,為了觀察血清誘導懸浮腫瘤球細胞的分化現(xiàn)象,選擇生長狀態(tài)良好的OE19懸浮腫瘤細胞球,加至含10% FBS的RPMI1640培養(yǎng)液中,倒置顯微鏡下觀察懸浮腫瘤細胞球再次貼壁及細胞形態(tài)的變化情況,并拍照記錄。

1.3 MTT體外增殖實驗檢測OE19懸浮腫瘤球細胞的增殖能力

采用MTT法測定細胞增殖。分別取OE19親本細胞(完全培養(yǎng)基培養(yǎng)2周以上的細胞)和OE19懸浮腫瘤球細胞(無血清培養(yǎng)),使用胰酶消化后制成單細胞懸液,以1×103個/孔的密度將細胞加入7塊96孔板中,終體積為200 μl,均用含10% FBS的RPMI-1640培養(yǎng),設空白組,每組均設5個復孔。在37 ℃、5% CO2條件下培養(yǎng)。接種后連續(xù)7 d,每隔24 h取出一塊培養(yǎng)板,去除培養(yǎng)基,PBS洗2次,加入終濃度為5 mg/ml的MTT溶液,37 ℃孵育4 h，棄上清,每孔加入150 μl的DMSO處理15 min,酶標儀檢測490 nm處的吸光度值(OD)。繪制細胞生長曲線,比較兩者增殖能力的差異。

1.4 單細胞克隆形成實驗檢測OE19懸浮腫瘤球單個細胞的增殖能力

取OE19親本細胞和OE19懸浮腫瘤細胞球,胰酶消化,使用無血清培養(yǎng)基稀釋成50個細胞/100 μl,以每孔2 μl分別接種于96孔板中,無血清體系的終體積為200 μl。37 ℃、5%CO2培養(yǎng)。倒置顯微鏡下觀察,對單個細胞孔做標記并記錄其孔數(shù)量,培養(yǎng)2周,分別統(tǒng)計形成懸浮腫瘤細胞球的孔數(shù),比較兩組懸浮腫瘤細胞球形成率的差別。懸浮腫瘤細胞球形成率=形成懸浮腫瘤細胞球的孔數(shù)/接種單個細胞孔數(shù)×100%。

1.5 Transwell小室侵襲實驗檢測OE19懸浮腫瘤球細胞的侵襲能力

按1 ∶4的比例將Matrigel膠與無血清RMPI1640培養(yǎng)液混勻,包被Transwell小室底部,室溫風干4-5 h。吸出培養(yǎng)板中殘余的液體,取OE19親本細胞和OE19懸浮腫瘤細胞球,制備單細胞懸液并計數(shù)。Transwell小室內分別加入1×104細胞,小室外加入含10% FBS的RPMI1640培養(yǎng)基。常規(guī)培養(yǎng)12 h后取出小室,用棉棒輕輕擦去微孔膜上層細胞,4%多聚甲醛固定,1%結晶紫染色,PBS漂洗,顯微鏡下觀察小室膜下層細胞。隨機記錄5個視野的細胞數(shù),統(tǒng)計結果。每組實驗重復3次。

1.6 real-time PCR檢測OE19懸浮腫瘤球細胞CSCs標志分子ABCG2、CD133的mRNA表達

取OE19親本細胞和OE19懸浮腫瘤細胞球,使用Trizol法提取總RNA,紫外分光光度計測定RNA在260 nm和280 nm的吸光度值,并根據(jù)A260值計算RNA濃度。總RNA按照標準程序進行逆轉錄(反應條件:37 ℃ 15 min,85 ℃ 5 s),反轉錄產(chǎn)物cDNA于-20 ℃凍存?zhèn)溆谩DNA在ABI定量PCR儀上進行兩步法real-time PCR反應(反應條件:預變性95 ℃ 30 s,變性95 ℃ 5 s,退火、延伸60 ℃ 30 s,40個循環(huán))。采用ABI 7300 SDS Software進行數(shù)據(jù)分析。mRNA的表達量表示為對照組細胞的N倍,N=樣品表達量/基準表達量=(2-樣本ΔCt)/(2-基準ΔCt)。每組實驗重復3次[8]。

CSCs標志分子ABCG2、CD133以及內參β-actin的引物由大連寶生物工程有限公司合成,實驗所需引物序列見表1。

1.7 Western blot檢測OE19懸浮腫瘤球細胞CSCs標志分子ABCG2、CD133的蛋白表達

取OE19親本細胞和OE19懸浮腫瘤細胞球,使用蛋白裂解法提取總蛋白,使用BCA法進行蛋白定量。1×Loading buffer將樣品調成相同濃度,沸水煮5-10 min將蛋白變性。取適當?shù)鞍讟悠愤M行SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳,使用半干電轉的方法將蛋白轉印至PVDF膜上,5%脫脂奶粉封閉4 h。加入待檢測的ABCG2(1 ∶1 000)和CD133(1 ∶1 000)一抗,將β-actin(1 ∶1 000)作為內參照,4 ℃過夜。PBST洗膜,加辣根過氧化物酶標記的相應二抗(1 ∶10 000),室溫孵育2 h,PBST洗膜,PBS沖洗。ECL顯色,化學發(fā)光系統(tǒng)觀察并拍照。使用IPP軟件檢測條帶,結果以各組蛋白與內參的比值表示[9]。

表1 CSCs標志分子的引物序列

Table 1 Primer sequences of cancer stem cell markers

標志分子 Sequence(5'-3') ABCG2Forward:CACAAGGAAACACCAATGGCTReverse:ACGCCTTGTCCTTGGTAGTGTTG CD133Forward:AGTGGCATCGTGCAAACCTGReverse:CTCCGAATCCATTCGACGATA β-actinForward:TGGCACCCAGCACAATGAAReverse:CTAAGTCATAGTCCGCCTAGAAG-CA

1.8 裸鼠成瘤實驗檢測OE19懸浮腫瘤球細胞的體內成瘤能力

4-6周齡裸小鼠,雌性,由西安交通大學醫(yī)學院實驗動物中心提供,于恒定溫度(22-25 ℃)、恒定濕度(40%-50%)的SPF層流室中分籠飼養(yǎng),食用高壓滅菌的標準飼料和水。

取OE19親本細胞和OE19懸浮腫瘤細胞球,制成單細胞懸液。OE19親本細胞以1×105/100 μl、1×104/100 μl和1×103/100 μl接種于小鼠左側背部皮下,OE19懸浮腫瘤球細胞以1×104/100 μl、1×103/100 μl和1×102/100 μl接種于小鼠右側背部皮下。每組6只鼠,每天觀察腫瘤形成以及生長情況,每3 d測量1次移植瘤的大小,連續(xù)4周,至觀察期達12周。腫瘤體積V=a×b2/2(a為長徑,b為短徑)。處死、解剖小鼠,剝取腫瘤稱重、測量瘤體積,拍照并將兩組移植瘤行HE染色。

1.9 統(tǒng)計學分析

2 結果

2.1 無血清分離培養(yǎng)OE19懸浮腫瘤細胞球

OE19細胞在含10% FBS的培養(yǎng)液中貼壁生長,貼壁細胞呈梭形伸展。而在無血清條件培養(yǎng)液中,消化成為單細胞接種3 d后,部分單細胞形成若干大小、形態(tài)不等的懸浮腫瘤細胞球,細胞間連接較緊密。培養(yǎng)6-8 d后,細胞球包含的腫瘤細胞數(shù)目逐漸增多,細胞呈球形或橢圓形立體生長,體積逐漸增大。生長至10 d左右,形成含數(shù)十個腫瘤細胞的懸浮腫瘤細胞球,呈橢圓形或者類圓形,球內細胞結合緊密,球體飽滿,折光性強(見圖1)。說明在無血清條件培養(yǎng)液中,部分OE19細胞能夠存活并增殖形成懸浮腫瘤細胞球。

將OE19懸浮腫瘤細胞球消化后繼續(xù)置于無血清培養(yǎng)環(huán)境中,一部分可以再形成新的腫瘤細胞球,依次傳代,連續(xù)10代以上仍然可以形成腫瘤細胞球。OE19懸浮腫瘤細胞球的生長隨著代數(shù)的增多有加速趨勢,完全培養(yǎng)基中的OE19親本細胞則無此特點(見圖2)。說明無血清培養(yǎng)條件下,OE19懸浮腫瘤細胞球中的部分細胞具有很強的自我更新能力,并且CSCs富集的程度可隨傳代的增多而提高。

圖1 不同培養(yǎng)時間OE19懸浮腫瘤細胞球的形態(tài)(×200)Figure 1 The morphology of floating tumor spheres of OE19 cells under inverted phase contrast microscope at different culture time points (×200)

圖2 不同傳代次數(shù)OE19懸浮腫瘤細胞球的形態(tài) (×200)Figure 2 The morphology of OE19 floating tumor spheres in various generations under inverted phase contrast microscope (×200)

2.2 含血清條件下OE19懸浮腫瘤球細胞的分化

將OE19懸浮腫瘤細胞球置于含血清環(huán)境中,12 h后腫瘤細胞球周邊可見細胞貼壁,貼壁細胞呈梭形伸展;隨著時間的延長,貼壁細胞逐漸增多,且腫瘤細胞球逐漸縮小;培養(yǎng)48 h后,腫瘤球細胞全部貼壁;繼續(xù)培養(yǎng)細胞聚集成團生長,失去典型的細胞形態(tài)(見圖3)。說明在含血清條件下,OE19懸浮腫瘤球中的部分細胞具備多向分化為異質腫瘤細胞的能力。

2.3 OE19懸浮腫瘤球細胞的增殖能力

用MTT法分別檢測OE19親本細胞以及OE19懸浮腫瘤球細胞的增殖情況。結果顯示,OE19懸浮腫瘤細胞球組的吸光值(A值)較對照組OE19親本細胞明顯增高,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05,見圖4)。說明OE19懸浮腫瘤球細胞的增殖能力明顯高于OE19親本細胞。

圖3 含血清培養(yǎng)基中OE19懸浮腫瘤球細胞的分化能力 (×200)Figure 3 The differentiation ability of OE19 floating tumor sphere cells under inverted phase contrast microscope (×200)

與對照組比較，*P<0.05圖4 MTT檢測OE19懸浮腫瘤球細胞的增殖能力Figure 4 The proliferation ability of OE19 floating tumor sphere cells by MTT assay

取單個OE19懸浮腫瘤球細胞以及OE19親本細胞進行無血清培養(yǎng),培養(yǎng)2周,計算克隆球形成率。結果顯示,OE19懸浮腫瘤細胞球組克隆球形成率為(13.37±1.36)%,而OE19親本細胞組觀察2周無一形成克隆球。上述實驗說明,無血清培養(yǎng)篩選出的OE19懸浮腫瘤球中富集了具有自我更新能力的腫瘤細胞。

2.4 OE19懸浮腫瘤球細胞的侵襲能力

Transwell侵襲實驗發(fā)現(xiàn),OE19懸浮腫瘤細胞球組穿過微孔膜的細胞數(shù)為(216±34)個/視野,對照組OE19親本細胞穿過微孔膜的細胞數(shù)為(73±18)個/視野,差異有顯著的統(tǒng)計學意義(P<0.01,見圖5)。說明OE19懸浮腫瘤球組細胞比OE19親本細胞具有更強的侵襲能力。

2.5 OE19懸浮腫瘤球細胞的ABCG2和CD133的mRNA表達

通過real-time PCR檢測在OE19親本細胞及OE19懸浮腫瘤球細胞中的CSCs標志ABCG2和CD133的mRNA表達差異，結果顯示,OE19懸浮腫瘤細胞球組ABCG2的mRNA表達與對照組OE19親本細胞中ABCG2的mRNA表達分別為1.70±0.17和1.00±0.25,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05，見圖6);OE19懸浮腫瘤細胞球組CD133的mRNA表達與對照組OE19親本細胞中CD133的mRNA表達分別為2.43±0.26和1.00±0.14,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01,見圖6)。提示在mRNA水平,OE19懸浮腫瘤球細胞中CSCs標志ABCG2和CD133的表達明顯升高。

與親本細胞比較,**P<0.01圖5 Transwell檢測OE19懸浮腫瘤球細胞的侵襲能力(×200)Figure 5 The invasion ability of OE19 floating tumor sphere cells by Transwell assay (×200)

2.6 OE19懸浮腫瘤球細胞的ABCG2和CD133的蛋白表達

通過Western blot檢測在OE19親本細胞及OE19懸浮腫瘤球細胞中的CSCs標志ABCG2和CD133蛋白表達的差異，結果顯示,經(jīng)β-actin標準化定量后,懸浮腫瘤球細胞組中ABCG2的蛋白表達

與親本細胞比較,*P<0.05,**P<0.01圖6 Real-time PCR檢測OE19懸浮腫瘤球細胞中CD133和ABCG2的mRNA表達Figure 6 The mRNA expression of ABCG2 and CD133 in OE19 floating tumor sphere cells by real-time PCR assay

與親本細胞組比較,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05,見圖7)、懸浮腫瘤細胞球組中CD133的蛋白表達與對照組OE19親本細胞中CD133的蛋白表達分別為4.63±0.52和1.00±0.11,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01,見圖7)。提示在蛋白水平,OE19懸浮腫瘤球細胞中CSCs標志ABCG2和CD133的表達明顯升高。

與對照組比較,*P<0.05,**P<0.01圖7 Western blot檢測OE19懸浮腫瘤球細胞中CD133和ABCG2蛋白的表達Figure 7 The protein expression of ABCG2 and CD133 in OE19 floating tumor sphere cells by Western blot assay

2.7 OE19懸浮腫瘤球細胞裸鼠體內致瘤能力

取OE19親本細胞和OE19懸浮腫瘤細胞球,制成單細胞懸液,分別以1×102/100 μl(A組),1×104/100 μl(B組)和1×106/100 μl(C組)接種100 μl至裸鼠左側以及右側背部皮下，觀察并記錄移植瘤形成的時間、瘤體大小。移植后第28天處死小鼠,移植瘤組織行HE染色病理檢查。結果顯示,觀察至第28天,接種OE19親本細胞的A組和B組裸鼠未見腫瘤形成、C組裸鼠可見腫瘤形成,接種OE19懸浮腫瘤球細胞的A、B、C三組裸鼠均可見腫瘤形成(見表2,圖8)。同一組中,OE19懸浮腫瘤球細胞的成瘤速度及成瘤率均高于OE19親本細胞,OE19懸浮腫瘤球細胞成瘤力顯著強于OE19親本細胞,成瘤潛伏期也要短于OE19親本細胞組。移植瘤病理切片行HE染色,均可見典型的AEG腫瘤組織表現(xiàn)(見圖9)。說明OE19懸浮腫瘤球細胞具有更強的體內致瘤能力。

表2 OE19懸浮腫瘤球細胞的裸鼠成瘤情況

Table 2 Tumor formation of OE19 tumor sphere cells in nude mice

分組n成瘤小鼠數(shù)量(個)親本細胞懸浮腫瘤球細胞A組601B組604C組656

3 討論

CSCs不但具有無限增殖的潛能,而且具有多向分化的能力,能夠產(chǎn)生不同表型的腫瘤細胞,使腫瘤不斷增大[10]。CSCs對放化療耐受,并且能夠逃脫血液免疫細胞的攻擊。CSCs還具有強大的侵襲能力,能夠通過血液循環(huán)、淋巴循環(huán)、種植等途徑轉移到其他器官并生長[11]。目前,在結腸癌、乳腺癌、肺癌以及肝癌等多種實體腫瘤中,已成功分離并鑒定出CSCs[12-16]。

AEG的CSCs的分離是研究者亟待解決的問題之一。SP細胞篩選法、表面標記物篩選法、無血清懸浮培養(yǎng)法以及耐藥培養(yǎng)法等是分離和富集CSCs的主要方法。然而,染色分離過程中使用的染料的毒性可以干擾SP細胞的成瘤能力,依靠特異性標記物分選出的陽性CSCs則因為細胞亞群數(shù)量少、壽命短而不利于長期實驗,并且包括AEG在內的多數(shù)腫瘤的CSCs表面特異性標志物也尚不明確。由于一般腫瘤細胞在無血清培養(yǎng)環(huán)境中難以存活,而CSCs則能夠在該環(huán)境中生存，擴增形成懸浮腫瘤細胞球，并且長期保持未分化狀態(tài)[15]。并且,無血清培養(yǎng)法具有簡單、快速、經(jīng)濟、高效的優(yōu)點[14]。因此,國內外研究者多使用無血清非黏附培養(yǎng)法分離特異性標志物未知腫瘤的CSCs[13,14,17,18]。另外,真正的CSCs能夠形成二代、三代甚至以上的細胞球,為保證結果的可靠性,本研究所有實驗均使用第三代懸浮腫瘤細胞球。

左:OE19親本細胞,右:OE19懸浮腫瘤球細胞圖8 裸鼠皮下食管癌異種移植瘤生長第28天的形態(tài)觀察Figure 8 The morphology of subcutaneously esophageal cancer xenografted tumors after transplanted for 28 d

圖9 裸鼠皮下食管癌異種移植瘤組織HE染色的病理形態(tài)觀察 (×400)Figure 9 The pathological morphology of subcutaneously esophageal cancer xenografted tumors by HE staining (×400)

CSCs除了具有自我更新、多向分化兩大特性之外,還必須具有較強的致瘤性[16]。因此,鑒定CSCs是從腫瘤中分離出特定的細胞亞群,再對這群細胞進行體外增殖實驗、克隆形成實驗、侵襲實驗以及再分化實驗以及動物體內成瘤實驗等研究,進一步驗證其CSCs特性。其中,缺乏免疫力的動物體內成瘤實驗是鑒定CSCs的“金標準”[13,15]。本研究使用無血清培養(yǎng)法從AEG細胞OE19中分離富集可穩(wěn)定傳代的懸浮腫瘤細胞球,并通過體外MTT實驗、單細胞克隆形成實驗、血清分化實驗、Transwell實驗以及裸鼠體內成瘤實驗等研究證明,無血清培養(yǎng)獲得的OE19懸浮腫瘤細胞球比OE19親代細胞具有更強的增殖能力、成瘤能力、自我更新能力、分化能力和侵襲轉移能力。

干細胞相關基因的表達對于CSCs干性的維持具有重要作用,這些基因的表達上調與其強大的增殖、自我更新和分化能力緊密相關,也是鑒定CSCs的常用方法之一[19]。多種腫瘤CSCs高表達ABCG2以及CD133,是可重復性較高的CSCs標志物[13,20]。ABCG2又稱乳腺癌耐藥蛋白,是ATP結合盒轉運蛋白,能夠介導腫瘤細胞對多種化療藥物的抵抗[16]。CD133是轉膜糖蛋白,其高表達往往提示惡性生物學行為和高復發(fā)風險[13]。AEG的CSCs沒有公認的分子標志物。本研究在成功分離培養(yǎng)出AEG的OE19細胞株懸浮腫瘤球的基礎上,針對ABCG2和CD133進行檢測。Real-time PCR以及Western blot的結果顯示,OE19懸浮腫瘤球細胞ABCG2和CD133的mRNA以及蛋白的表達明顯高于OE19親本細胞,差異有統(tǒng)計學意義,其中以CD133的差異尤為明顯。結果提示,ABCG2和CD133在OE19懸浮腫瘤細胞球的共表達細胞,可能是具有CSCs特性的亞群。

總之,本研究使用無血清培養(yǎng)AEG的OE19細胞,分離、富集出OE19懸浮腫瘤細胞球,是快速易行的方法;進而通過體內外的一系列研究證實,OE19懸浮腫瘤球細胞表現(xiàn)出更強的CSCs特性,高表達CSCs標志分子CD133和ABCG2,可能是代表AEG CSCs的亞群。本研究為AEG CSCs生物學特性的深入研究以及靶向治療奠定了前期實驗基礎。

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Serum-free suspension culture and identification of cancer stem cells from human OE19 cell line

YIN Xiaoran1*,FENG Cheng2,MA Yinan1,GAO Xiaoyan1,LIU Xin2,JIA Lijun1,ZHANG Yinbin1,ZHANG Jun2

(1DepartmentofOncology,SecondAffiliatedHospitalofXi’anJiaotongUniversity,Xi’an710004,China;2DepartmentofDigestion,SecondAffiliatedHospitalofXi’anJiaotongUniversity;*Correspondingauthor,E-mail:yinxiaoran@163.com)

ObjectiveTo isolate the floating tumor spheres from human type Ⅱesophageal-gastric junction adenocarcinoma cell line OE19, and to identify their cancer stem cell characteristics.MethodsOE19 cells were cultured in the serum-free medium to form the floating tumor spheres, and OE19 parent cells were cultured in serum medium with 10%FBS. MTT assay, single cell clone formation experiment, serum differentiation test and Transwell assay were employed to observe the proliferation, self-renewal, differentiation and invasive abilities of OE19 tumor spheres and OE19 parent cells. Real-time PCR and Western blot assays were performed to detect the expression of stem cell markers(ABCG2 and CD133) in OE19 tumor sphere cells and OE19 parent cells. OE19 tumor sphere cells and OE19 parent cells were inoculated subcutaneously in nude mice and the tumor growth was assessed to identify the cancer stem cell property.ResultsIn the serum-free medium, the cancer stem cells isolated from OE19 cells grew as floating tumor spheres, which had stable transmission and multi-directional differentiation characteristics. The expression of stem cell markers such as ABCG2 and CD133 in OE19 tumor sphere cells was higher than that in OE19 parent cells(P<0.05). Moreover, the proliferation, self-renewal, proliferation and invasive abilities of OE19 tumor sphere cells, and the tumorigenicity in nude mice of OE19 tumor sphere cells were stronger than that of OE19 parent cells(P<0.05).ConclusionIsolating tumor spheres without adhesion from OE19 cells in serum-free medium can be a quick and easy method.The floating tumor spheres are of high expression of ABCG2 and CD133, and possess cancer stem cell characteristics.

esophageal-gastric junction adenocarcinoma; OE19 cells; serum-free culture; cancer stem cell; tumor sphere

國家自然科學基金資助項目(81274136);陜西省社發(fā)攻關基金資助項目(2011K13-02-05)

尹曉然,女,1980-12生,博士,副主任醫(yī)師,E-mail:yinxiaoran@163.com

2017-04-05

R735

A

1007-6611(2017)08-0800-08

10.13753/j.issn.1007-6611.2017.08.010