雌激素對去卵巢大鼠焦慮行為及杏仁核c-fos表達的影響

蘇曉云,賀繼平,鄭 華

(1山西醫科大學汾陽學院護理學系護理人文教研室,汾陽 032200;2山西醫科大學汾陽學院基礎醫學部解剖教研室;3重慶師范大學體育學院)

雌激素對去卵巢大鼠焦慮行為及杏仁核c-fos表達的影響

蘇曉云1,賀繼平2,鄭 華3

(1山西醫科大學汾陽學院護理學系護理人文教研室,汾陽 032200;2山西醫科大學汾陽學院基礎醫學部解剖教研室;3重慶師范大學體育學院)

目的 觀察雌二醇對去卵巢大鼠焦慮樣行為及杏仁核c-fos表達的影響,探討雌二醇改善去卵巢大鼠焦慮樣行為的可能機制。 方法 30只SD雌性大鼠隨機分為假手術組、卵巢切除組和去卵巢雌二醇組。雌二醇治療8周后通過高架迷宮實驗觀察雌二醇對去卵巢大鼠焦慮樣行為的影響;隨后采用免疫組織化學結合圖像半定量方法對杏仁核c-fos的表達進行測量和分析。 結果 與假手術組大鼠比較,高架迷宮實驗中卵巢切除組大鼠開放臂次數及時間、開放臂次數比例及時間比例均顯著下降(P<0.01),杏仁核c-fos數量及面積均顯著增加(P<0.05);而去卵巢雌二醇組去卵巢大鼠的焦慮行為可顯著改善,杏仁核c-fos表達減弱(P<0.05)。 結論 卵巢摘除會導致大鼠焦慮樣行為,長期雌二醇治療可改善去卵巢大鼠的焦慮行為,可能與雌二醇降低去卵巢大鼠杏仁核c-fos的表達有關。

雌二醇; 杏仁核; c-fos; 焦慮樣行為； 去卵巢； 大鼠

焦慮癥是最常見的精神疾病,美國每年將近18%人口患此病。一般來說,女性比男性更容易患焦慮癥,特別是絕經后,因此可以認為性腺激素在焦慮性行為的病因及流行方面發揮重要作用[1,2]。Tangen等[3]研究認為,與絕經前比較,圍絕經期及絕經后的婦女易患焦慮和抑郁癥狀,支持促性腺激素與女性情緒障礙的關系。此外,Rasgon等[4]認為雌激素替代治療可選擇性增強抑制女性患抑郁癥的血清素再吸收,而通過開場實驗及強迫游泳實驗證實,給予去卵巢大鼠雌激素治療后焦慮行為顯著改善[5]。這些結果表明雌激素參與情緒和情感的調控,然而雌激素調節焦慮行為的機制仍不清楚。

杏仁核是一個復雜的大腦核團,在調節焦慮樣行為、恐懼條件反射及情感記憶中扮演重要角色[6],研究認為杏仁核包含大量的雄激素和雌激素受體,并且杏仁核雌激素受體在雌激素調節焦慮樣行為中發揮重要作用[7]。c-fos蛋白被認為是中樞神經系統神經元形態和神經激活的標記,本課題組前期研究發現卵巢切除可導致紋狀體c-fos表達減少,但是有關卵巢切除對杏仁核c-fos的表達的影響相關報道較少。因此,本實驗利用雌性去卵巢大鼠模擬絕經后女性,以杏仁核c-fos為研究重點,觀察去卵巢大鼠雌激素治療8周大鼠焦慮樣行為及杏仁核c-fos表達的變化,旨在探討雌二醇改善去卵巢大鼠抑郁行為的可能機制。

1 材料與方法

1.1 動物及分組

3月齡SD雌性大鼠30只,體質量220-250 g,均購于山西醫科大學動物飼養中心(動物許可證號SCXK-2009-0001)。所有大鼠被飼養在標準鼠籠中,每籠3只,所有大鼠可自由攝食、飲水。適應環境1周后,將30只大鼠隨機分為假手術組(sham group)、卵巢切除組(OVX)和去卵巢雌二醇組(OVX+E2)。OVX+E2組大鼠每天上午9:00-10:00腹腔注射苯甲酸雌二醇0.1 ml(1 mg/ml),連續8周。

1.2 卵巢切除手術操作

[8]方法操作,大鼠經腹腔注射烏來糖(50 mg/kg)麻醉,常規消毒后進行雙側卵巢切除術,在恥骨聯合上緣約2 cm處切開皮膚,進入腹腔,沿輸卵管找到雙側卵巢后切除卵巢(假手術組大鼠只切除腹腔內一小塊脂肪組織),然后縫合切口,所有大鼠術后肌注青霉素3 d。

1.3 高架迷宮實驗

卵巢切除8周對所有大鼠進行高架迷宮實驗。高架迷宮(兩條相對開放臂及閉合臂組成),距離地面50 cm。根據參考文獻[9]描述的方法將大鼠放在迷宮中心區探索5 min,焦慮行為指標包括:①開放臂次數(open arm entry,OE)及時間(open arm time,OT);②開放臂次數比例(OE%):開放臂次數/(開放臂次數+閉合臂次數)×100%;③開放臂時間比例(OT%):開放臂時間/(開放臂時間+閉合臂時間)×100%。OE%及OT%比值越小,表明大鼠的焦慮程度越嚴重。

1.4 下丘腦室旁核c-fos取材、切片與染色

高架迷宮實驗測試結束后即刻,大鼠被麻醉后經常規灌注固定,然后行腦冠狀位連續冰凍切片,片厚30 μm。隨后經過氧化氫/甲醇溶液(3%)室溫孵育30 min,以消除內源性過氧化物酶活性,PBS沖洗后加入5%山羊血清工作液孵育1 h,加入c-fos血清兔抗大鼠第一抗體(1 ∶2 000),4 ℃孵育24 h加入生物素羊抗兔IgG第二抗體,接著DAB室溫顯色15 min,清洗、貼片,常規梯度酒精脫水、二甲苯透明,樹膠封片(以上所有試劑均由武漢博士德生物工程有限公司生產)。

1.5 圖像分析

參照大鼠腦立體定位圖譜每組取10張切片,在鏡下輸入圖像分析系統,每張切片隨機觀察5個視野測量杏仁核c-fos(400倍)陽性細胞數及面積,求其平均值。

1.6 統計學分析

2 結果

2.1 雌二醇對去卵巢大鼠高架迷宮實驗的影響

在高架迷宮實驗中,與SHAM組比較,OVX大鼠OE、OT、OE%及OT%均顯著下降(均P<0.01,見表1),OE%及OT%下降幅度分別為33.22%及43.43%;而OVX+E2組大鼠與sham組比較,上述指標均無顯著差異(P>0.05);給予雌激素替代治療8周,與OVX組大鼠比較,OVX+E2組大鼠OE、OT、OE%及OT%均顯著增加(P<0.01或P<0.05,見表1),增加幅度分別為86.97%,68.96%,37.89%及56.73%。結果提示,長期慢性雌二醇治療可顯著改善去卵巢大鼠的焦慮行為。

組別 OE(次) OT(s) OE%(%) OT%(%)sham組4.51±1.5648.56±13.2635.45±11.9716.67±4.57OVX組2.38±0.98ΔΔ26.45±8.46ΔΔ23.67±6.65ΔΔ 9.43±1.68ΔΔOVX+E2組4.45±2.01**44.69±10.89**32.64±9.46*14.78±4.35**

與sham組比較,ΔΔP<0.01;與OVX比較,*P<0.05，**P<0.01

2.2 雌二醇對去卵巢大鼠c-fos表達的影響

與假手術組比較,卵巢切除組大鼠杏仁核c-fos陽性細胞數量及面積均顯著增高(均P<0.05，見表2),增加幅度分別為30.57%及20.05%;去卵巢雌二醇組大鼠與假手術組大鼠比較,杏仁核c-fos表達無顯著變化(P>0.05);與卵巢切除組大鼠比較,去卵巢雌二醇組大鼠杏仁核c-fos陽性細胞數量及面積均顯著下降(P<0.01),降低幅度分別為18.64%

組別n 面積(μm2)陽性細胞數(個)sham組10348.68±48.45 8.34±1.06OVX組10418.59±70.22Δ10.89±1.87ΔOVX+E2組10362.96±41.38* 8.86±0.97*

與sham組比較,ΔP<0.05;與OVX組比較,*P<0.05

及13.29%。免疫組化結果顯示,OVX大鼠杏仁核c-fos免疫陽性神經元表達增強;雌二醇注射8周大鼠杏仁核c-fos免疫陽性神經元表達減弱(見圖1)。

圖1 不同處理組大鼠杏仁核c-fos表達Figure 1 The c-fos positive expression in amygdala in different groups by immunohistochemistry

3 討論

女性圍絕經期時由于循環激素水平改變可能導致認知缺陷和/或情緒障礙。Walf等[10]通過開場試驗及高架迷宮實驗證實卵巢摘除可以降低大鼠對新異環境的探究能力、增強大鼠對高懸敞開臂的恐懼,表現出焦慮及抑郁行為。然而Imwalle等[11]通過高架迷宮實驗證實,雌激素剝奪大鼠不會產生焦慮樣行為。有學者認為雌激素剝奪時間與焦慮行為呈顯著的正相關,大鼠雌激素剝奪15 d,30%的動物出現焦慮狀態,而雌激素剝奪21-28 d,60%-90%的動物出現焦慮狀態,這些結果表明,雌激素剝奪至少3周以上才可以引起大鼠焦慮狀態[12]。此外,有研究表明雌激素剝奪時間與焦慮癥狀呈顯著的負相關,雌激素剝奪時間越長焦慮癥狀越明顯[13]。因此,本研究采用大鼠卵巢摘除模擬女性圍絕經期時雌激素水平下降狀態,通過高架迷宮實驗觀察雌激素剝奪8周大鼠焦慮樣行為的變化,結果顯示OVX大鼠在高架迷宮實驗中開放臂次數及時間、開放臂次數及時間百分比均顯著減少,說明OVX大鼠表現出了對新環境的探究能力下降和對高懸開放臂的恐懼程度增加,出現了嚴重的焦慮情緒。大多數研究表明雌二醇主要由卵巢分泌,可減少更年期動物模型的焦慮行為和產生抗抑郁癥狀。臨床研究發現在絕經后婦女,雌激素替代療法已被證明可以改善心理癥狀與焦慮狀態[14]。而通過高架T迷宮實驗證實,接受慢性雌二醇治療的OVX大鼠表現出抗焦慮作用[15]。本研究也證實了上述觀點,OVX大鼠經過8周雌二醇治療焦慮癥狀明顯改善,具體表現為高架迷宮實驗中OVX+E2大鼠開放臂次數及時間、開放臂次數及時間百分比均顯著增加,提示長期雌激素治療可以在一定程度上改善OVX大鼠的焦慮狀態,與其他學者研究結果一致。

c-fos是原癌基因家族中成員之一,在體內相當于第三信使的作用,可直接參與細胞的分裂、生長、分化及學習記憶等生理過程,并且在調節焦慮樣行為中發揮重要作用[16]。研究發現,性腺激素雌二醇可以調節c-fos的表達,然而研究結果差異較大。有些學者認為去卵巢可導致下丘腦室旁核、視交叉上核及弓狀核c-fos表達減少,而注射高劑量雌二醇可以使c-fos表達恢復到正常水平[17,18]。而有些研究認為卵巢切除可增加包括皮質、杏仁核、丘腦等大腦區域的c-fos表達,而每天重復注射苯甲酸雌二醇(10 μg)可降低c-fos的表達[19]。本研究與后者結果相同,與假手術組比較,去卵巢大鼠杏仁核c-fos表達顯著增加。研究認為,c-fos蛋白在誘導細胞凋亡方面起著決定性的作用[20],且細胞凋亡的產生會損壞腦細胞,最近的研究顯示有些凋亡基因表達與焦慮的發展有很大的相關性[21]。因此,有理由推測本實驗中雌激素剝奪大鼠的焦慮樣行為與杏仁核c-fos的過度表達導致的杏仁核神經細胞凋亡有關。而雌二醇替代治療改善雌激素剝奪大鼠焦慮行為可能與雌二醇下調c-fos表達減少杏仁核神經細胞凋亡有關,具體機制需進一步研究。

4 小結

去卵巢可導致大鼠焦慮樣行為及杏仁核c-fos表達增加,而去卵巢大鼠長期注射雌二醇可減弱大鼠焦慮行為,杏仁核c-fos表達減弱,因此推測雌二醇減弱去卵巢大鼠焦慮行為可能與雌二醇下調c-fos表達降低杏仁核神經細胞凋亡有關。

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Effects of estradiol on anxiety-like behavior and amygdala c-fos expression in ovariectomized rats

SU Xiaoyun1,HE Jiping2,ZHENG Hua3

(1DepartmentofNursingHumanities,FenyangCollegeofShanxiMedicalUniversity,Fenyang032200,China;2DepartmentofAnatomy,FenyangCollegeofShanxiMedicalUniversity;3DepartmentofPhysicalEducation,ChongqingNormalUniversity)

ObjectiveTo explore the influence of estradiol on anxiety-like behavior and amygdala c-fos expression and the possible mechanism of estradiol improving anxiety-like behavior of the ovariectomized(OVX) rats.MethodsThirty adult SD female rats were randomly assigned into 3 groups: sham group, OVX group and OVX+E2 group(ovariectomized rats treated with estradiol). The elevated plus maze was used to assess the anxiety-like behavior after 8-week estradiol treatment. Immunohistochemical staining was used to detect the c-fos expression in amygdala.ResultsCompared with sham group, open arm entry(OE), open arm time(OT), the percentage of OE and the percentage of OT significantly decreased in OVX group(P<0.01), while the number and area of amygdala c-fos expression significantly increased(P<0.05). Compared with OVX group, anxiety-like behavior was improved and amygdala c-fos expression decreased after 8-week estradiol treatment in OVX+E2group(P<0.05).ConclusionThe ovariectomy may induce the anxiety-like behavior, and estradiol may ameliorate the anxiety-like behavior in OVX rats by decreasing the amygdala c-fos expression.

estradiol; amygdala; c-fos; anxiety-like behavior； ovariectomized; rats

蘇曉云,女,1982-04生,碩士,講師

2017-03-31

R749.2

A

1007-6611(2017)08-0791-04

10.13753/j.issn.1007-6611.2017.08.008