高效液相色譜—柱后光化學衍生法測定大米粉中黃曲霉B1含量

李紅梅　朱聿元　韓華

摘 要：該研究建立了高效液相色譜-柱后光化學衍生法測定大米粉中黃曲霉毒素B1含量的方法。色譜柱采用安捷倫C18柱（150mm×4.6mm，5μm），以甲醇[∶]水=40[∶]60為流動相，采用熒光檢測器測定大米粉中黃曲霉毒素B1的含量。黃曲霉毒素B1的線性范圍為5～100ng/mL，檢出限為1ng/mL，平均加標回收率為94.6%，相對標準偏差0.74%。該方法簡單、快速、準確、重現性好，適用于大米粉中黃曲霉毒素B1的定量分析。

關鍵詞：黃曲霉毒素B1；高效液相色譜；柱后衍生；熒光檢測器

中圖分類號 TS272 文獻標識碼 A 文章編號 1007-7731（2017）15-0135-3

Abstract：A high performance liquid chromatography method for separation and determination of Aflatoxin B1 in rice meal was established. The analytical column was Agilent C18（150mm×4.6mm，5μm），the mobile phase was methanol-water（40∶60，V/V），the samples were determined by an fluorescence detector with post-column photochemical reaction. The calibration curves had good linearity in the range of 5～100ng /mL for Aflatoxin B1，the detection limit for Aflatoxin B1 was 1ng/mL，the average recoveries of RA were 94.6%（n=6，RSD=0.74%）.The method was a convenient，rapid and effective method for qualitatively analysis of Aflatoxin B1 in rice meal.

Key words：Aflatoxin B1；HPLC；Post-column derivatization；Fluorescence detector

黃曲霉毒素B1（Aflatoxin B1，AFTB1）是二氫呋喃氧雜萘鄰酮的衍生物，含有一個雙呋喃環和一個氧雜萘鄰酮（香豆素）[1-3]。黃曲霉毒素B1污染的食物主要是花生、玉米、稻谷、小麥、花生油等糧油食品，且以南方高溫、高濕地區受污染最為嚴重。黃曲霉毒素耐熱，280℃才可裂解，故一般烹調加工溫度下難以破壞。黃曲霉毒素B1是已知的化學物質中致癌性最強的一種。目前，文獻報道的分離方法有層析法[4-5]、酶聯免疫法[5-6]、液相色譜法[7-11]、液質聯用法[12-17]等，其中高效液相色譜法由于具方法簡便、準確等伏點而被廣泛采用。但由于黃曲霉毒素B1的紫外最大吸收波長為365nm，前處理麻煩，而免疫親和層析-柱后光化學衍生法能夠定量準確，適用于食品中黃曲霉毒素B1含量的測定。因此，本研究應用高效液相色譜-柱后衍生法對大米粉中黃曲霉毒素B1含量的測定進行了研究。

1 材料與方法

1.1 材料和儀器 黃曲霉毒素B1標準品（LGC公司）、大米粉（江蘇省食品藥品監督檢驗研究院提供）；乙腈（色譜純），Tedia公司；實驗用水，超純水；黃曲霉毒素B1免疫親和柱（美國beacon，3mL）。1200液相色譜-熒光檢測器，安捷倫公司；光化學衍生器（華安麥科）；Synergy超純水機，美國密理博公司；BSA224S電子天平，Sartorius公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 色譜條件選擇 色譜柱：安捷倫C8柱（150mm×4.6mm，5μm），安捷倫C18柱（150mm×4.6mm，5μm）；流動相：甲醇：水=40[∶]60；熒光，激發波長360nm，發射波長大于420nm；進樣量10μL；流速0.8mL/min。色譜柱方面，實驗選擇了C8和C18 柱，因為這2種種柱子做黃曲霉毒素B1比較常見，是分析實驗中常用柱子。實驗中發現黃曲霉毒素B1在C8柱子中分離效果不好，只有在C18柱子上能夠達到很好的分離。流動相的選擇中，在甲醇[∶]水=40[∶]60時候，標準品達到很好的基線分離。

1.2.2 標準溶液配制 準確稱取黃曲霉毒素B1標準品10mg，用流動相溶解后定容至10mL容量瓶中，搖勻，該溶液作為標準儲備溶液。準確移取上述溶液并且用流動相稀釋定容為5，10，20，50，100ng/mL，經0.45μm濾膜過濾，取續濾液備用，作為標準品溶液。

1.2.3 大米粉樣品制備 準確稱取試樣25.0g于250mL具塞錐形瓶中，加入5.0g氯化鈉及甲醇-水（7+3）至125.0mL，以均質器高速攪拌提取2min。定量濾紙過濾，準確移取15.0mL濾液并加人30.0mL水稀釋，用玻璃纖維濾紙過濾1～2次，至濾液澄清，備用。準確移取15.0mL樣品提取液過美國beacon免疫親和柱，1.0mL甲醇洗脫，收集全部洗脫液于玻璃試管中，供檢測用。

2 結果與分析

2.1 線性關系的考察 精密吸取AFTB1標準溶液10[μL]，注入高效液相色譜儀，記錄色譜圖。以峰面積為縱坐標，以濃度（ng/mL）為橫坐標，繪制標準曲線（圖1），得到回歸方程：y=0.776846x-0.530622，R2=0.99931。AFTB1在5～100ng/mL之間線性關系良好。并以信噪比等于3為標準，測得AFTB1的檢出限為1ng/mL。

2.2 精密度試驗 精密吸取AFTB1標準品溶液10[μL]重復進樣6次，記錄色譜圖峰面積，并測定峰面積的平均值和相對標準偏差，測定結果見表1。連續6次實驗結果顯示，精密度實驗相對標準偏差為1.45%，本實驗測定AFTB1精密度良好，具有良好的準確度。

2.4 回收率實驗 精密稱取樣品約25g，精密加入AFTB1約3.5mg，按照1.2.3大米粉樣品制備樣品溶液，供液相色譜進行AFTB1分析，外標法定量。測定結果見表3。由表3中可知，回收率在93.5%～96.2%，平均回收率為94.6%，表明高效液相色譜-柱后衍生法檢測大米粉中AFTB1含量具有良好的準確性。

2.5 樣品測定 取6批樣品按1.3.3方法制備樣品溶液，精密吸取樣品供試液10μL，AFTB1標準溶液10μL，分別注入高效液相色譜儀，以外標法計算含量，見表4，樣品中AFTB1含量都在20.046以上，相對標準偏差為0.74%。AFTB1標準品及樣品的HPLC色譜圖見圖2、圖3，從圖2和圖3可知，通過上述條件標準品和樣品都能夠達到很好的基線分離，出峰時間在7.159min左右，結果令人滿意。

3 結論

本文采用高效液相色譜-柱后光化學衍生法測定大米粉中黃曲霉毒素B1含量，對實驗條件進行了優化，采用安捷倫C18柱（150mm×4.6mm，5μm），以甲醇[∶]水=40[∶]60為流動相分離效果較好，并對該條件了進行了實驗方法的考察和實際樣品的測定，結果表明，該方法穩定、準確、快速，適用于大米粉中中黃曲霉毒素B1的含量測定。

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（責編：張宏民）