患者及相關(guān)環(huán)境分離CRKP的耐藥譜與同源性

楊竹蘭，張 震，劉智勇，吳 昊，張 波

(1 第三軍醫(yī)大學(xué)附屬西南醫(yī)院, 重慶 400038； 2 重慶市人民醫(yī)院，重慶 400014)

·論著·

患者及相關(guān)環(huán)境分離CRKP的耐藥譜與同源性

楊竹蘭1，張 震2，劉智勇1，吳 昊1，張 波1

(1 第三軍醫(yī)大學(xué)附屬西南醫(yī)院, 重慶 400038； 2 重慶市人民醫(yī)院，重慶 400014)

目的了解某醫(yī)療機構(gòu)耐碳青霉烯類肺炎克雷伯菌(CRKP)感染患者臨床分離株與環(huán)境分離株的同源性。方法收集該院1例患者分離的CRKP與該患者周圍環(huán)境中檢出的4例肺炎克雷伯菌，測定5株菌對臨床上常用抗菌藥物的敏感性，利用改良Hodge試驗和CIM(Carbapenem Inactivation Method)試驗檢測5株菌產(chǎn)碳青霉烯酶情況，采用脈沖場凝膠電泳(PFGE)對其進行同源性分析。結(jié)果藥敏試驗結(jié)果顯示，5株肺炎克雷伯菌(1株來自患者，4株來自于患者所在的病房環(huán)境，分離自護工手、溶液瓶口、升降扶手、床欄桿)除對頭霉素類、氨基糖苷類抗生素的藥敏結(jié)果不一致外，對其他各類抗菌藥物均表現(xiàn)為耐藥。改良Hodge試驗和CIM試驗證實5株菌均產(chǎn)碳青霉烯酶；PFGE結(jié)果顯示，病房溶液瓶口、床欄桿、病床升降扶手同患者標(biāo)本分離的CRKP電泳圖譜一致，為同一菌株，而護工手同患者標(biāo)本分離的CRKP電泳圖譜有2條條帶的差異，其菌株間有相近的關(guān)系。結(jié)論患者及其周圍環(huán)境檢出同一種CRKP，應(yīng)嚴(yán)格執(zhí)行醫(yī)院感染控制制度，隔離感染患者，加強環(huán)境的清潔與消毒，避免醫(yī)院感染暴發(fā)。

肺炎克雷伯菌； 碳青霉烯酶類抗生素； 脈沖場凝膠電泳； 同源性分析

[Chin J Infect Control，2017，16(8)：693-697]

肺炎克雷伯菌(Klebsiellapneumoniae, K.pn)是醫(yī)院和社區(qū)獲得性感染的重要腸桿菌科病原菌，廣泛分布于自然界，存在于土壤和水中，人和動物腸道內(nèi)更常見。碳青霉烯類抗生素是目前治療腸桿菌科細菌，尤其是產(chǎn)超廣譜β-內(nèi)酰胺酶(extended-spectrum β-lactamases, ESBLs)和AmpC酶等多重耐藥菌引起的嚴(yán)重感染最有效的抗菌藥物之一[1]。近年來，隨著此類抗生素的廣泛應(yīng)用，臨床逐漸出現(xiàn)了耐碳青霉烯類抗生素的腸桿菌科細菌，特別是耐碳青霉烯類抗生素肺炎克雷伯菌(carbapenem-resistantKlebsiellapneumoniae, CRKP)的報道逐年增多，涉及的國家和區(qū)域越來越廣，所引起的醫(yī)療機構(gòu)相關(guān)性感染(healthcare-associated infection，HAI)暴發(fā)流行逐年遞增，給臨床抗該菌感染治療和醫(yī)療機構(gòu)相關(guān)性感染控制帶來極大的挑戰(zhàn)[2-3]。目前，脈沖場凝膠電泳(pulsed-field gel electrophoresis，PFGE)仍然是病原菌流行病學(xué)調(diào)查和分子分型的金標(biāo)準(zhǔn)[4]，通過分子分型確定菌株間流行病學(xué)相關(guān)性，對預(yù)防和監(jiān)測肺炎克雷伯菌引起的醫(yī)療機構(gòu)相關(guān)性感染具有積極作用。本研究采用PFGE技術(shù)，對醫(yī)療機構(gòu)相關(guān)性感染患者臨床分離株與該患者所住病房環(huán)境中分離的肺炎克雷伯進行同源性分析，探討患者病原菌與其周圍環(huán)境分離病原菌的關(guān)系，追蹤醫(yī)院感染來源，明確傳播途徑，為減少醫(yī)院感染的發(fā)生提供理論依據(jù)，為其他醫(yī)療機構(gòu)醫(yī)院感染管理科工作人員控制醫(yī)院感染提供參考案例。

1 對象與方法

1.1 菌株來源 患者標(biāo)本分離的CRKP來源于本院檢驗科微生物室，環(huán)境來源的4株CRKP來源于本院醫(yī)院感染管理科。質(zhì)控菌株為大腸埃希菌ATCC 25922、金黃色葡萄球菌ATCC 25923、肺炎克雷伯菌ATCC BAA-1705和ATCC BAA-1706，均購于中國工業(yè)微生物菌種保藏中心。

1.2 儀器與試劑 VITEK 2 Compact全自動微生物分析系統(tǒng)及革蘭陰性桿菌鑒定卡、革蘭陰性桿菌藥敏卡購自于法國Bio Merieux公司,脈沖場凝膠電泳儀購自美國Bio-Rad公司,溶菌酶購自Sigma公司,蛋白酶K購自Roche公司,ApaⅠ限制性內(nèi)切酶購自TOYOBO公司。

1.3 方法

1.3.1 標(biāo)本采集 本院醫(yī)院感染管理科通過實時監(jiān)控系統(tǒng)及檢驗科微生物檢驗報告得知，某科室1例患者多次檢出CRKP。為預(yù)防和控制CRKP醫(yī)院感染暴發(fā)，醫(yī)院感染管理科于該患者連續(xù)3次分離CRKP后開展醫(yī)院感染調(diào)查,對患者周邊環(huán)境進行了工作狀態(tài)下的微生物采樣(此時距該患者第一次分離CRKP僅一周時間)，共采樣17份標(biāo)本，采樣后微生物培養(yǎng)嚴(yán)格參照《醫(yī)療機構(gòu)消毒技術(shù)規(guī)范》(WS/T 367-2012)[5]及《全國臨床檢驗操作規(guī)程》[6]進行。

1.3.2 菌株鑒定和藥敏試驗 所有菌株均由VITEK 2 Compact全自動微生物分析系統(tǒng)進行鑒定及藥敏試驗，藥敏判斷標(biāo)準(zhǔn)及質(zhì)控按照2016年版美國臨床實驗室標(biāo)準(zhǔn)化協(xié)會(CLSI)標(biāo)準(zhǔn)[7]執(zhí)行。

1.3.3 改良Hodge試驗 根據(jù)2016年版CLSI推薦，將0.5麥?zhǔn)蠁挝坏拇竽c埃希菌標(biāo)準(zhǔn)菌株ATCC 25922菌液稀釋10倍后均勻涂布在MH平皿上，中間貼上10 μg/片厄他培南的紙片，將受試菌株以厄他培南紙片為起點，沿離心方向劃線，35℃培養(yǎng)過夜，抑菌圈內(nèi)呈現(xiàn)矢狀者為陽性。以肺炎克雷伯菌標(biāo)準(zhǔn)菌株ATCC BAA 1705為陽性對照，以肺炎克雷伯菌ATCC BAA 1706為陰性對照。

1.3.4 CIM(carbapenem inactivation method )試驗 參考文獻[8]，用10 μL接種環(huán)刮取要檢測細菌的菌落至滿環(huán),加入400 μL的蒸餾水中,混勻后放入含量為10 μg的美羅培南藥敏紙片，35℃溫育至少2 h，在MH藥敏平皿上均勻涂布0.5 麥?zhǔn)蠁挝坏拇竽c埃希菌標(biāo)準(zhǔn)菌株ATCC 25922，將溫育好的美羅培南藥敏紙片貼到平皿板上，35℃溫育至少6 h，觀察結(jié)果。如果藥敏紙片周圍無抑菌圈，則為產(chǎn)碳青霉烯酶，如果藥敏紙片周圍有抑菌圈，則為陰性。

1.3.5 PFGE 操作步驟參考文獻[9-10]描述的方法并略加改進。菌種復(fù)活后，挑取新鮮單個菌落用3 mL CSB溶液制備成約4.0 麥?zhǔn)蠁挝坏木鷳乙海?00 μL菌懸液于50℃水浴中與1 g/dL低熔點瓊脂糖凝膠等體積混合,靜置制成凝膠塊。凝固后將凝膠塊投入到2 mL含有200 μL溶菌酶(20 mg/mL)的CLB溶液中，37℃ 120 r/min干熱振蕩過夜，吸去CLB溶液，加入含20 μL蛋白酶K(20 mg/mL)的2 mL CLB溶液中55℃ 120 r/min干熱振蕩過夜，吸去CLB溶液，用50℃ TE溶液洗膠5次，每次50℃,120 r/min 15 min。最后將膠塊置于TE溶液中保存于4℃?zhèn)溆谩Ｇ邢?～3 mm大小膠塊，浸入150 μL酶切體系中(其中含XbaⅠ酶30 U)，37℃水浴中酶切過夜。電泳參數(shù)為6 V/cm，脈沖時間5～20 s，14℃，120度夾角，電泳時間15 h。電泳結(jié)束后，將凝膠取出，用GeneGreen液染色30 min，去離子水脫色，凝膠成像系統(tǒng)觀察并拍照。

1.4 結(jié)果判定 參考《實用臨床微生物學(xué)檢驗與圖譜》[11]及文獻[12]：PFGE圖譜一致說明為相同菌株,1～3條帶有差異說明菌株間有相近關(guān)系，且只有單基因的改變；4～6條帶有差異說明菌株間可能有相近關(guān)系，表示有兩個獨立基因的差異；如果菌株間有6條或更多條帶差異，說明有3個或更多基因變化，被視為無相關(guān)性。

2 結(jié)果

2.1 臨床資料 患者男性，74歲，因左側(cè)頂枕葉腦出血入院，入院前2年有過兩次開顱手術(shù)史，術(shù)后生活基本能自理。本次入院后第5天出現(xiàn)低熱，胸片提示肺部感染，行氣管插管切開術(shù)，同時送檢合格痰培養(yǎng)，檢出鮑曼不動桿菌。之后每隔2 d送檢1次痰培養(yǎng)，第14天痰培養(yǎng)檢出CRKP(菌株縮寫：K.pn 1)。

2.2 患者病房環(huán)境微生物采樣結(jié)果 醫(yī)院感染管理科工作人員從檢驗科微生物報告中發(fā)現(xiàn)該患者3次分離出CPKP，遂對此菌株進行了重新鑒定和藥敏試驗，結(jié)果與檢驗科微生物室報告結(jié)果相同。感染管理科工作人員對該患者病房環(huán)境多位點進行了工作狀態(tài)下的微生物采樣，培養(yǎng)結(jié)果顯示，患者周圍環(huán)境帶菌量較高，除呼吸機Savina 3接口以及護士手帶菌量在合格范圍(≤10 CFU/cm2)之內(nèi)外，其他環(huán)境采樣標(biāo)本含菌量均遠>10 CFU/cm2。對其中的常見病原菌進行鑒定，發(fā)現(xiàn)流量表、柜子表面環(huán)境中檢出鮑曼不動桿菌，護工手、溶液瓶口、升降扶手、床欄桿均檢出CRKP。具體環(huán)境各位點采樣微生物檢測結(jié)果見表1。

2.3 病原菌藥物敏感試驗結(jié)果 醫(yī)院感染管理科工作人員對分離的5株肺炎克雷伯菌(1株來自患者，4株來自于患者所在的病房環(huán)境)進行藥敏試驗，結(jié)果顯示，5株肺炎克雷伯菌除對頭霉素類、氨基糖苷類抗生素的藥敏結(jié)果不一致外，對其他各類抗菌藥物均表現(xiàn)為耐藥。見表2。

2.4 改良Hodge試驗 5株肺炎克雷伯菌改良Hodge試驗均呈陽性，證明5株肺炎克雷伯菌均產(chǎn)生碳青霉烯酶。見圖1。

2.5 CIM試驗結(jié)果 5株肺炎克雷伯菌的抑菌圈均為6 mm，證明5株肺炎克雷伯菌均產(chǎn)碳青霉烯酶，水解美羅培南，使大腸埃希菌ATCC 25922對美羅培南呈現(xiàn)耐藥結(jié)果。見圖2。

表1 患者病房環(huán)境中微生物采樣菌落計數(shù)及肺炎克雷伯菌檢出情況

表2 5株肺炎克雷伯菌對抗菌藥物的MIC值及藥敏試驗結(jié)果

圖1 5株肺炎克雷伯菌改良Hodge 試驗陽性

圖2 5株肺炎克雷伯菌CIM試驗陽性結(jié)果

2.6 PFGE結(jié)果 根據(jù)PFGE圖譜判讀標(biāo)準(zhǔn)，病房溶液瓶口、床欄桿、病床升降扶手同患者標(biāo)本分離的肺炎克雷伯菌電泳圖譜一致，為同一菌株，而護工手同患者標(biāo)本分離的肺炎克雷伯菌電泳圖譜有2條條帶的差異，其菌株間有相近的關(guān)系。見圖3。

M：為Marker，泳道 1—5分別為K.pn 1—K.pn 5

3 討論

肺炎克雷伯菌已成為醫(yī)院感染和免疫缺陷患者感染的重要機會致病菌，可通過患者之間交叉感染或呼吸機等醫(yī)療器械傳播[13]；碳青霉烯類抗生素是目前治療肺炎克雷伯菌感染最有效的抗生素[14]，隨著此類藥物在臨床上的廣泛應(yīng)用，對其耐藥的肺炎克雷伯菌日益增多。本研究中從患者痰標(biāo)本多次檢出了耐碳青霉烯類抗生素的肺炎克雷伯菌，為預(yù)防和控制該菌株引起的醫(yī)院感染暴發(fā)，醫(yī)院感染管理科立刻對患者周邊環(huán)境進行環(huán)境衛(wèi)生學(xué)采樣監(jiān)測，從周圍環(huán)境中共分離出4株CRKP。經(jīng)改良Hodge試驗和CIM試驗證實，本組肺炎克雷伯菌產(chǎn)碳青霉烯酶，與文獻報道我國泛耐藥腸桿菌科細菌耐藥機制主要為產(chǎn)生碳青霉烯酶的報告一致[15]。為進一步明確菌株的同源關(guān)系，我們采用目前病原菌分子分型的 “金標(biāo)準(zhǔn)”PFGE對其進行分子分型，結(jié)果證實5株肺炎克雷伯菌有高度同源性，證明患者分離CRKP極大可能來自于醫(yī)院環(huán)境，或許與醫(yī)務(wù)人員未嚴(yán)格執(zhí)行相關(guān)醫(yī)院感染控制制度有關(guān)。

據(jù)世界衛(wèi)生組織(World Health Organization)報告，在中低收入的國家，醫(yī)療機構(gòu)相關(guān)性感染發(fā)生率在5.7%～19.1%[16]，可見全球醫(yī)療機構(gòu)相關(guān)性感染控制形式仍然嚴(yán)峻，我國作為發(fā)展中的中等收入大國，醫(yī)療機構(gòu)相關(guān)性感染的控制任務(wù)仍然任重而道遠。本文作者在日常工作中通過實時監(jiān)測系統(tǒng)發(fā)現(xiàn)CRKP，并及時關(guān)注和追蹤，通過對患者和醫(yī)務(wù)人員密切接觸的環(huán)境進行采樣，尋找患者CRKP可能的來源，并對患者及時進行隔離，從源頭上阻止了醫(yī)療機構(gòu)相關(guān)性感染暴發(fā)的可能，為其他醫(yī)療機構(gòu)醫(yī)院感染管理科工作人員在日常工作中及時發(fā)現(xiàn)多重耐藥，尤其是泛耐藥菌，控制醫(yī)療機構(gòu)相關(guān)性感染的暴發(fā)提供了一個很好的案例。

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(本文編輯：左雙燕)

Antimicrobialresistanceprofileandhomologyofcarbapenem-resistantKlebsiellapneumoniaeisolatedfrompatientsandrelatedsurroundings

YANGZhu-lan1，ZHANGZhen2，LIUZhi-yong1，WUHao1，ZHANGBo1

(1SouthwestHospital，ThirdMilitaryMedicalUniversity,Chongqing400038,China; 2ChongqingPeople’sHospital,Chongqing400014,China)

ObjectiveTo understand the homology of clinical isolates from patients with carbapenem-resistantKlebsiellapneumoniae(CRKP) infection and isolates from environment in a medical institution.MethodsOne CRKP strain isolated from a patient in this hospital and 4 strains ofKlebsiellapneumoniae(K.pneumoniae) isolated from patient’s surroundings were collected, susceptibility of 5 strains to commonly used antimicrobial agents was detected, production of carbapenems in 5 strains were detected by modified Hodge testing and carbapenem inactivation method(CIM), homology analysis was performed by pulsed-field gel electrophoresis (PFGE).ResultsAntimicrobial susceptibility testing results showed that 5 strains ofK.pneumoniae(1 from patient, 4 from the patient’s ward surroundings, including hands of nursing aides, solution bottle opening, handle for lifting and dropping bed, and bedrail) were all resistant to other antimicrobial agents except to cephamycin and aminoglycosides. The modified Hodge testing and CIM confirmed that 5 strains all produced carbapenemases; PFGE results showed that electrophoretogram of CRKP isolated from solution bottle opening of ward, bedrail, and handle for lifting and dropping bed were the same as CRKP isolated from patient, while electrophoretogram of CRKP isolated from hands of nursing aides had 2 different bands, there was a close relationship between the strains.ConclusionThe same type of CRKP were isolated from patient and his surroundings, it is necessary to implement healthcare-associated infection(HAI) control system, isolate infected patient, and strengthen environmental cleaning and disinfection, so as to avoid the outbreak of HAI.

Klebsiellapneumoniae; carbapenems; pulsed-field gel electrophoresis; homology analysis

2017-01-24

國家自然科學(xué)基金項目(No.71373280);第三軍醫(yī)大學(xué)臨床創(chuàng)新基金項目(SWH2013LC08，SWH2014LC31)

楊竹蘭(1990-)，女(苗族)，貴州省凱里市人，檢驗技師，主要從事醫(yī)療機構(gòu)相關(guān)性感染研究。

張波 E-mail：zhangbocq@aliyun.com

10.3969/j.issn.1671-9638.2017.08.001

R181.3+2

A

1671-9638(2017)08-0693-05