苦參葉生物總堿提取工藝的優化及含量測定

陸平祝 常楚瑞 龍慶德 王曉麗 許德勇

摘要[目的]優化苦參葉生物總堿的提取工藝，并測定其所含的生物堿含量。[方法]采用紫外分光光度法進行單因素試驗和正交試驗，考察乙醇體積分數、料液比、提取溫度、提取時間、提取次數對苦參葉總生物堿含量的影響，并采用高效液相色譜法對生物堿含量進行測定。[結果]苦參葉生物總堿的最優提取工藝為：料液比1∶25，90 ℃水浴，80%乙醇，回流提取1次，提取時間2 h；苦參葉中苦參堿、槐定堿、氧化苦參堿含量較高。[結論]紫外分光光度法的生物總堿提取率高，穩定性、重現性好；苦參葉含有5種指標性成分，其中苦參堿和氧化苦參堿的含量總和符合藥典規定含量，葉的潛在應用價值大，為苦參葉的研發提供理論依據。

關鍵詞苦參葉；生物堿；工藝優化；含量測定；紫外分光光度法；HPLC

中圖分類號R284.2文獻標識碼A文章編號0517-6611（2017）17-0096-04

Abstract[Objective] The research aimed to optimize the extraction process of total alkaloids from Sophora flavescens leaves and determine the alkaloid content.[Method]The single factor test and orthogonal test were carried out by UV spectrophotometry，the optimum conditions of the extraction of total alkaloids from Sophora flavescens leaves were studied by ethanol volume fraction，solidliquid ratio，extraction temperature，extraction time and extraction times.And the content of alkaloids was determined by high performance liquid chromatography（HPLC）.[Result]The optimal extraction process of total alkaloids from Sophora flavescens leaves was as follows：solidliquid ratio was 1∶25，90 ℃ water bath，80% ethanol，reflux extraction one time，extraction time 2 h.The contents of matrine，sophoridine，oxymatrine were relatively high in Sophora flavescens leaves.[Conclusion] UV spectrophotometric method has stability，reproducibility and higher extraction ratio.Sophora flavescens leaves contain five kinds of indicator components，in which the total content of matrine and oxymatrine meets the requirements of pharmacopoeia.The potential application of the leaves is great，which provides the theoretical basis for the development of Sophora flavescens leaves.

Key wordsSophara flavescens Ait.leaves；Alkaloids；Process optimization；Content determination； UV spectrophotometry；HPLC

基金項目貴州省中藥現代化科技產業研究開發專項（黔科合ZY字〔2012〕3004號）；貴州省科技計劃項目（黔科合重大專項字〔2015〕6009-2）。

作者簡介陸平祝（1990—），女，侗族，貴州黎平人，碩士研究生，研究方向：中草藥研發。*通訊作者，副教授，從事中草藥研發工作。

收稿日期2017-03-31

苦參為豆科植物苦參（Sophara flavescens Ait.）的干燥根，其性味苦，性寒，有小毒[1]。作為傳統的中藥，臨床上主要應用其根部，其主要成分含有苦參堿、氧化苦參堿、槐定堿、槐果堿、氧化槐果堿。在中醫臨床應用中，苦參與其他中草藥配伍，可治療多種疾病[2-3]。通過現代醫學對苦參藥理毒性的全面分析和深入試驗研究，使苦參的應用范圍和領域擴大，苦參原料的用量也逐年增長。筆者采集樣品和考察苦參生態環境因子時發現苦參葉常被廢棄，現已經完成了苦參根、莖、葉生物總堿含量累積與生態因子的相關性初步研究，發現苦參葉生物總堿含量相對較高[4]，而目前對苦參葉的提取工藝研究鮮見報道。紫外分光光度法是鑒別苦參化合物的一種重要技術，目前廣泛用于測定中藥的總堿，該技術適合批量藥材的檢測。該試驗采用紫外分光光度法進行單因素試驗[5-7]和正交試驗，測定苦參葉總生物堿類化合物的含量，優化苦參葉的提取工藝，并采用高效液相色譜測定5種指標性生物堿，以期提高整株植物的藥用價值和經濟效益。

1材料與方法

1.1材料

1.1.1儀器。METTLER TOLEDO電子天平（梅特勒-托利多儀器上海有限公司）；AS系列超聲波清洗機（天津奧特賽恩斯儀器有限公司，250 W，100 kHz）；Q-250B高速多功能粉碎機（上海冰都電器有限公司）；UV-5800PC型紫外可見分光光度計（上海元析儀器有限公司）；HH-Z數顯恒溫水浴鍋（常州澳華儀器有限公司）；DROGON移液槍（上海恒奇儀器有限公司）；Agilent1100（VWD）。

1.1.2試材。苦參葉，2015年6月份上旬采摘于貴州黎平縣高屯鎮；苦參堿、氧化苦參堿、槐定堿標準品（中國食品藥品檢定研究院，批號110805-200508、110780-201007、110784-200804）；槐果堿、氧化槐果堿標準品（上海源葉生物科技有限公司，批號Z25A16L17029、Z18S6B3547）；乙腈、無水乙醇為色譜純，甲醇、無水乙醇為分析純，科倫試劑有限公司。

1.2方法

1.2.1對照品溶液的制備。

1.2.1.1苦參堿對照品。精密取苦參堿對照品5 mg，加到25 mL容量瓶中，加無水乙醇制成0.2 g/L的對照品溶液，即得。

1.2.1.2混合對照品。精密稱取苦參堿對照品、氧化苦參堿對照品、槐果堿對照品、槐定堿對照品、氧化槐果堿對照品，用甲醇溶解并制成含槐果堿0.022 9 mg/mL、苦參堿0083 2 mg/mL、氧化苦參堿0.491 2 mg/mL、槐定堿0.104 4 mg/mL、氧化槐果堿0.376 2 mg/mL的對照品儲備液。

1.2.2苦參堿標準曲線的繪制。

1.2.2.1測定波長的選擇。微量移液槍吸取對照品溶液100 μL分別加入25 mL具塞試管中，85 ℃水浴蒸干溶液后，加入溴麝香草酚藍磷酸氫二鈉緩沖溶液6 mL（pH=7.6），再精密加入三氯甲烷6 mL，密塞劇烈振搖2 min，放置30 min，使水層和三氯甲烷層完全分層后，棄去上清液；以0 mL對照品溶液，按照同樣方法得到空白對照。在紫外分光光度計200～800 nm進行掃描，結果顯示對照品溶液在416 nm 處有最大吸收，故選擇416 nm作為含量測定的波長，與報道的相關文獻相符[8]。

1.2.2.2 標準曲線的繪制。用微量進樣器精密吸取苦參堿對照品溶液0、100、150、200、250、300 μL分別加入25 mL具塞試管中，按照“1.2.2.1”方法測定其吸光度，以苦參總堿濃度為橫坐標、吸光度為縱坐標繪制標準曲線，得出線性回歸方程為y=0.043 9x+005 9（R2=0.999 2），表明苦參堿在255～6.80 μg/mL有良好的線性關系。

1.2.3單因素試驗設計。

1.2.3.1提取次數考察。取苦參葉3份，每份精密稱定20 g，于80 ℃水浴中，25倍量80%乙醇分別回流提取1、2、3次，每次1.0 h，按“1.2.2”方法測定苦參生物總堿。

1.2.3.2提取時間考察。取苦參葉4份，每份精密稱定2.0 g，于85 ℃水浴中，25倍量80%乙醇分別回流提取1.0、1.5、2.0、2.5 h，按“1.2.2”方法測定苦參生物總堿。

1.2.3.3料液比考察。取苦參葉4份，每份精密稱定2.0 g，于85 ℃水浴中，分別用15、20、25、30、35倍量的80%乙醇分別回流提取1 h，按“1.2.2”方法測定苦參生物總堿。

1.2.3.4乙醇體積分數考察。取苦參葉4份，每份精密稱定2.0 g，于85 ℃水浴中，用25倍量70%、75%、80%、85%、90%乙醇分別回流提取2 h，按“1.2.2”方法測定苦參生物總堿。

1.2.3.5提取溫度考察。取苦參葉4份，每份精密稱定2.0 g，分別于70、75、80、85、90 ℃水浴中，用25倍量80%乙醇分別回流提取2 h，按“1.2.2”方法測定苦參生物總堿。

1.2.4供試品溶液的制備。將苦參葉粉碎過3號篩（60目），精密稱取苦參葉粉末，利用單因素試驗中不同提取條件進行回流提取，所得提取液加入石油醚萃取5～6次，萃取至石油醚層顏色明顯變淺，棄去石油醚萃取液，目的是為了除去色素、樹脂等脂溶性雜質，得到苦參葉萃取溶液[9-10]。

1.2.5苦參生物總堿測定。微量加樣槍吸取供試品溶液150 μL加入25 mL具塞試管，按“1.2.2”方法測定苦參生物總堿。

1.2.6正交試驗法對苦參葉生物總堿提取工藝的優化。綜合單因素試驗，選取影響苦參葉生物總堿的料液比（A）、乙醇體積分數（B）、提取溫度（C）、提取時間（D）4個因素，以苦參生物總堿提取率為參考指標，分別取4因素3水平對苦參葉中生物堿的提取條件進行優化，正交試驗因素和水平見表1。

1.2.7HPLC色譜條件。色譜柱為Inertsil NH2（5 μm，4.6 mm×250 mm）；流動相為乙腈：無水乙醇：3%磷酸（84∶10∶6），檢測波長210 nm；柱溫30 ℃；進樣量10 μL；理論板數大于8 000。

2結果與分析

2.1單因素試驗

2.1.1提取次數考察。由圖1可知，苦參葉生物總堿提取率隨著提取次數的增加有明顯的下降趨勢，由于提取次數為非連續變量，回歸處理困難，固定提取次數為1次。

2.2.2提取時間考察。由圖2可知，提取時間在1.0～2.0 h，苦參葉生物總堿提取率增加，在2.0 h苦參葉生物總堿提取率最高，隨著時間的延長，苦參葉生物總堿提取率稍有下降。因此，最佳的提取時間是2.0 h。

2.2.3料液比考察。由圖3可知，料液比在1∶15～1∶25，苦參葉生物總堿提取率一直處于上升趨勢，料液比在1∶25時提取率達最高，隨著料液比不斷增加，苦參葉生物總堿提取率急速下降。因此，最適宜的料液比是1∶25。

2.2.4乙醇體積分數考察。由圖4可知，在乙醇體積分數為70%～85%時，苦參葉生物總堿提取率隨著乙醇濃度的增加而增大，在乙醇體積分數85%時苦參葉生物總堿提取率達到最高，隨后又下降的趨勢。因此，選擇乙醇體積分數為85%最合適。

2.2.5提取溫度考察。由圖5可知，在提取溫度為70～85 ℃時，苦參葉生物總堿的提取率隨溫度的升高而增加，提取溫度為85 ℃有利于苦參葉生物總堿的提取，而隨溫度的升高，苦參葉生物總堿提取率有下降趨勢。因此，最佳的提取溫度為85 ℃。

2.2正交試驗從表2可以看出，各因素對苦參葉生物總堿提取率的影響從大到小依次為A、C、D、B；方差結果表明，A、C對苦參葉生物總堿提取率有顯著影響（P<0.05），B、D的影響較小。由極差R可知，苦參葉生物總堿的最佳提取條件為A2B1C3D3，即料液比為1∶25，乙醇體積分數為80%，提取溫度為90 ℃，提取時間為2 h。

經過正交試驗得出最佳的提取工藝參數為：料液比為1∶25，在90 ℃水浴中80%乙醇回流提取1次，提取時間2 h；在此條件下，苦參葉生物總堿提取率的預測值為2.83%。對以上工藝參數進行驗證，經過3次平行試驗，得到的苦參葉生物總堿提取率平均值為2.86%，與預測值無顯著差異，表明該條件下苦參葉生物總堿提取率最大。

2.3樣品含量測定

2.3.1對照品和苦參供試品的圖譜。優化驗證下所得的溶液，精密量取“1.2.4”的苦參葉萃取液10 mL，經5 g無水硫酸鈉過濾，取續濾液在85 ℃水浴鍋蒸干，用甲醇溶解定容至10 mL，按照“1.2.7”色譜條件對混合對照品和供試品進行測定，所得色譜圖以AIA格式導入“中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統”軟件[11-14]。通過中位數評價、多點校正、自動匹配，生成具有綜合特征信息的參照圖譜（圖6a），再通過該軟件中“參照圖譜入檔”導入3份供試品提取物（圖6b），其與對照品圖的保留時間對比發現（圖6），在相同的位置有相應的色譜峰，其中1號峰為槐果堿，2號峰為苦參堿，3號峰為氧化槐果堿，4號峰為槐定堿，5號峰為氧化苦參堿。

2.3.2苦參葉的含量測定。精密量取“1.2.4”苦參葉萃取液10 mL，經5 g無水硫酸鈉過濾，取續濾液在85 ℃水浴鍋蒸干，用甲醇溶解定容至10 mL，按照“1.2.7”色譜條件測定含量，結果顯示（表3），苦參葉含有的5種生物堿的含量從大到小依次為氧化苦參堿、槐定堿、苦參堿、槐果堿、氧化槐果堿，其中苦參堿和氧化苦參堿的含量總和（1.25%）大于1.20%，達到《中華人民共和國藥典》規定苦參藥用部位的含量。

3結論與討論

采用紫外分光光度法進行單因素試驗和L9（34）正交試驗，最終確定最優提取工藝條件為：料液比為1∶25，乙醇體積分數為80%，提取溫度為90 ℃，提取時間為2 h。試驗結果表明，該方法簡單、快速、準確，可以作為測定苦參中總堿含量的一種有效方法。

考慮近幾年苦參堿及氧化苦參堿有效應用于臨床的需求量越來越大，資源逐年減少，該試驗對總堿含量比較大的苦參葉的提取工藝進行了優化，為苦參及其制劑的進一步開放與研究提供數據分析；探討苦參葉的含量，為苦參植物不同組織器官的合理開發利用和保護苦參植物資源提供科學依據，避免資源浪費。

參考文獻

[1] 國家藥典委員會.中華人民共和國藥典：2010版一部[S].北京：化學工業出版社，2010：188.

[2] 付佃華，付亞杰，張棟棟.苦參堿在婦科疾病方面的實驗及臨床研究進展[J].基層醫學論壇，2015，19（4）：551-552.

[3] 冉賢金，胡虞乾.氧化苦參堿和拉米夫定體外抗乙肝病毒的比較[J].中國生化藥物雜志，2012，33（2）：142-144.

[4] 陸平祝，常楚瑞，龍慶德，等.黔產苦參根、莖、葉中生物堿含量累積與生態因子的相關性[J].中國實驗方劑學雜志，2017，23（6）：43-47.

[5] 敖道夫，巴達拉胡，布日額.正交實驗法優選苦參總堿提取工藝[J].內蒙古民族大學學報（自然科學版），2009，24（1）：75-78.

[6] 駱冉冉，劉文娣，鄧麗莉，等.響應面法優化黃芩莖葉總黃酮提取工藝[J].食品安全質量檢測學報，2013，4（6）：1865-1872.

[7] 周瀅，費曜.川產趕黃草不同部位的槲皮素含量比較[J].世界科學技術—中醫藥現代，2014，16（9）：2047-2049.

[8] 楊美玲，曹新錄，崔東亞，等.苦參堿的提取與含量測定[J].浙江農業科學，2011，11（2）：413-415.

[9] 王曉華，朱華，王孝勛，等.廣西莪術葉與根莖、塊根揮發油的比較研究[J].時珍國醫國藥，2012，23（7）：1650-1652.

[10] 田浩，石瑤，吳麗華，等.不同產地不同部位云黃連生物堿成分累積研究[J].云南大學學報（自然科學版），2012，34（5）：570-576.

[11] 丁璞，王冰，宋新，等.HPLC測定五味子根莖葉中6種木脂素含量[J].中國中藥雜志，2013，38（13）：2078-2081.

[12] 陳曉蘭，黃麗英，黃麗萍，等.不同產地金線蓮根莖和葉中多糖含量對比[J].分析測試技術與儀器，2012，18（3）：135-139.

[13] 呂佳，王丹，張振秋，等.HPLC同時測定苦參藥材中5種生物堿含量[J].中國中醫藥信息雜志，2013，20（9）：61-62，81.

[14] 李克，王曙東，吳龍琴，等.HPLC同時檢測山豆根中苦參堿和氧化苦參堿含量[J].解放軍藥學學報，2014，30（1）：55-57.