基于纖維降解能力分析的青貯飼料發(fā)酵用靈芝菌株的篩選

丁琳 薛綠艷 趙雅敏 錢蕾 李佳華 盧曉鳳 曹軍

摘要[目的]獲得較適宜秸稈降解的靈芝菌株。[方法]通過顯色圈法初篩和比色法復(fù)篩從28株食品級靈芝菌種中篩選適宜秸稈發(fā)酵的靈芝菌株的方法。[結(jié)果]添加黑芝進(jìn)行青貯飼料的輔助發(fā)酵，經(jīng)過1 d即可進(jìn)入乳酸發(fā)酵階段，45 d即可獲得pH小于4.2的青貯飼料，且具有較高的纖維素酶和木質(zhì)素酶活力的菌株發(fā)酵所得的飼料中乳酸含量更高。[結(jié)論]添加靈芝可以加速乳酸發(fā)酵的起始時間，并能縮短青貯飼料發(fā)酵的周期，提高飼料中的乳酸含量。

關(guān)鍵詞靈芝；青貯飼料；纖維降解；乳酸發(fā)酵

中圖分類號S816.5+3文獻(xiàn)標(biāo)識碼A文章編號0517-6611（2017）17-0088-03

Abstract[Objective] To screen out Ganoderma lucidum strain for straw degradation. [Method] Ganoderma lucidum strain for straw fermentation was screened out from 28 strains of foodlevel strains of G. lucidum by color circle method and colorimetric screening. [Result] Ganoderma neojaponicum was added to assist the fermentation of silage， it entered the fermentation stage of lactic acid after one day. After 45 days， silage with pH of less than 4.2 was obtained. The feed fermented with strain with higher activities of cellulase and ligninase had high content of lactic acid. [Conclusion] Adding G. lucidum can accelerate the start time of lactic acid fermentation， shorten the cycle of silage fermentation， and increase the content of lactic acid in feed.

Key wordsGanoderma lucidum；Silage；Fiber degradation；Lactic acid fermentation

基金項目南通大學(xué)大學(xué)生創(chuàng)新訓(xùn)練計劃項目（2016061）。

作者簡介丁琳（1995—），女，江蘇江陰人，本科生，專業(yè)：微生物學(xué)。*通訊作者，講師，博士，從事天然產(chǎn)物活性研究。

收稿日期2017-04-12

目前，世界秸稈的年產(chǎn)量為20億～30億t，我國近年秸稈可收集資源量約3億t/a，由于多種原因，1/3以上的秸稈被廢棄或直接焚燒，造成了極大的資源浪費(fèi)[1]。秸稈經(jīng)過青貯發(fā)酵后不僅能保存青綠飼料的新鮮和絕大部分的營養(yǎng)，而且還可以增加飼料芳香的酸味、使飼料柔軟多汁、能刺激家畜的食欲、消化液的分泌和腸道的蠕動，增加采食量，提高飼料的消化利用率[2]。盡管國內(nèi)外的現(xiàn)有研究結(jié)果已經(jīng)提供了青貯飼料的基本加工工藝及過程，并對其加工工藝進(jìn)行了優(yōu)化，如通過添加各類微生物、添加糖源、添加纖維素制劑等方式促進(jìn)青貯體系乳酸發(fā)酵的進(jìn)行[3]，但青貯飼料的制作過程仍存在發(fā)酵周期長、纖維素類物質(zhì)降解不充分、動物吸收率不高等問題。

筆者嘗試采用靈芝進(jìn)行青貯飼料的發(fā)酵，利用靈芝的纖維素酶和木質(zhì)素酶進(jìn)行秸稈纖維類組分的降解，并利用靈芝代謝的各類活性物質(zhì)調(diào)節(jié)動物的免疫等，以改善青貯飼料的品質(zhì)。筆者對實驗室現(xiàn)有靈芝菌種進(jìn)行了篩選，考察各株菌的纖維素酶及木質(zhì)素酶活力，以期獲得具有較高纖維素酶和木質(zhì)素酶活力的菌株，提高發(fā)酵體系中的小分子糖比例，旨在為后續(xù)的靈芝輔助發(fā)酵秸稈的相關(guān)試驗奠定基礎(chǔ)，為秸稈的綜合利用提供借鑒。

1材料與方法

1.1試驗材料

為保證發(fā)酵飼料的安全性，試驗所用靈芝菌種均為醫(yī)用或食用菌株，所有菌株購自梁山正大食用菌研究所，共28株。

1.2試驗方法

1.2.1菌種的活化。

將菌種接種于PDA平板上，28 ℃下培養(yǎng)4～5 d，待其菌絲長到整個平板的2/3后，取邊緣菌絲再次轉(zhuǎn)接到PDA平板上，28 ℃下培養(yǎng)進(jìn)行二次活化。

1.2.2纖維素酶及木質(zhì)素酶活力的半定量分析[4-5]。

①纖維素酶。采用剛果紅透明圈法，將固體活化的菌種接種于含1% CMC的PDA平板上，28 ℃下培養(yǎng)3 d，用0.1%剛果紅染液染色30 min后，棄染液，用1 mol/L NaCl溶液脫色1 h后測量菌落直徑d和透明圈直徑D，以D/d為篩選指標(biāo)，初步篩選出纖維素酶活力較高的菌株。

②木質(zhì)素酶。采用愈創(chuàng)木酚法，將菌種接種于含有001%愈創(chuàng)木酚的PDA平板上，28 ℃下培養(yǎng)3 d，測量菌落直徑d和透明圈直徑D，以D/d為篩選指標(biāo)，初步篩選出木質(zhì)素酶活力較高的菌株。

1.2.3纖維素酶及木質(zhì)素酶活力的定量分析[4-5]。

用直徑1 cm的打孔器將PDA平板上的邊緣菌絲接種到秸稈產(chǎn)酶培養(yǎng)基[1 L含秸稈粉（玉米秸稈粉碎后過100目篩）10 g、硫酸銨4 g、磷酸二氫鉀2 g、七水硫酸鎂0.5 g、蛋白胨10 g、牛肉膏5 g]中28 ℃、180 r/min培養(yǎng)3 d，取發(fā)酵液6 000 r/min離心25 min，上清液即為粗酶液。

1.2.3.1纖維素酶活力的測定。

采用DNS顯色法測定，反應(yīng)體系中加入1.5 mL 1% CMC溶液，再加入0.5 mL粗酶液，50 ℃水浴30 min（對照無需水浴），再加入2 mL DNS溶液，沸水浴5 min，流水冷卻至室溫，于540 nm處測定吸光值。

纖維素酶活力單位定義為1 min內(nèi)轉(zhuǎn)化1 μmol/L底物所需的酶量為1個活力單位（U）。

1.2.3.2木質(zhì)素酶活力的測定。

（1）漆酶（Lac酶）活力。漆酶活力的測定采用ABTS氧化法。反應(yīng)體系中加入500 μL 100 mmol/L pH 4.5的丙二酸緩沖液，再加入500 μL 0.6 mmol/L的ABTS，30 ℃水浴5 min，對照無需水浴并置于冰上。最后，加入50 μL粗酶液啟動反應(yīng)，在420 nm處測量吸光度，并記錄l min內(nèi)吸光值的變化。

（2）錳過氧化物酶（Mnp）活力。反應(yīng)體系中加入500 μL 100 mmol/L pH 4.5的丙二酸緩沖液和100 μL 10 mmol/L MnSO4，并加入350 μL的蒸餾水維持一定的體系，再加入10 mmol/L 的H2O2 10 μL，30 ℃水浴5 min，對照無需水浴并置于冰上。最后，加入50 μL的粗酶液啟動反應(yīng)，在270 nm處測量吸光度，并記錄1 min內(nèi)吸光值的變化。

（3）木質(zhì)素過氧化物酶（LiP）活力。反應(yīng)體系中加入500 μL 200 mmol/L pH 3.0的酒石酸緩沖液和100 μL 40 mmol/L的藜蘆醇，并加入350 μL的蒸餾水維持一定的體系，再加入20 mmol/L的 H2O2 10 μL，30 ℃水浴5 min，對照無需水浴并置于冰上。最后，加入50 μL的粗酶液啟動反應(yīng)，在310 nm波長處測定吸光度，并記錄1 min內(nèi)吸光值的變化。

木質(zhì)素酶活力單位定義為單位時間內(nèi)吸光度變化0.1為1個活力單位（U）。

1.2.4青貯飼料的制備及質(zhì)量分析。

1.2.4.1

靈芝菌種的液體發(fā)酵。將靈芝接種于PDA培養(yǎng)基，28 ℃條件下倒置培養(yǎng)3 d，然后打孔取菌餅接入100 mL PDA液體培養(yǎng)基，28 ℃、150 r/min振蕩培養(yǎng)3 d，獲得種子培養(yǎng)液。按1%的比例接種于液體發(fā)酵罐中，28 ℃，攪拌轉(zhuǎn)數(shù)200～500 r/min，控制溶氧量在30%，發(fā)酵5 d后獲得pH為（4.5±0.5）的含懸浮菌絲的發(fā)酵液（菌體干重達(dá)8～9 g/L），用于青貯飼料的發(fā)酵。

1.2.4.2

青貯飼料的制備[6]。將玉米在乳熟后期收獲（含水量65% ～ 70%），切成1～2 cm的小段，分裝在青貯袋中，每裝入20～30 g青貯袋中壓實1次，減少殘留空氣，每袋裝100 g。試驗組按3%的比例接種靈芝發(fā)酵液，每種菌株做3個平行，常溫密閉發(fā)酵，分別放置1、2和45 d，開袋即獲得靈芝青貯飼料；對照組不接菌。

1.2.4.3

酸度的測定[7]。稱取10 g青貯飼料，浸入25 mL蒸餾水中，4 ℃密封過夜，抽濾，取濾液，使用pH計測定飼料直接酸度。取2 mL濾液，用2 mL乙酸乙酯萃取，回收上層乙酸乙酯，取5 μL進(jìn)行氣相色譜分析（GCMS2010-QP2010，島津）。分析條件如下：進(jìn)樣室溫度240 ℃，F(xiàn)ID檢測器溫度250 ℃，1∶5分流進(jìn)樣，色譜柱為Ptx-5（30 m×0.25 mm×025 μm，Restek，USA），載氣為氮氣，柱溫90 ℃，乳酸保留時間為2.338 min。

1.3數(shù)據(jù)處理

試驗結(jié)果均以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。使用Excel 2007軟件對試驗數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計分析與繪圖，組間差異顯著性采用t檢驗分析，P<0.05表示差異顯著，P<0.01表示差異極顯著。

2結(jié)果與分析

2.1纖維素酶和木質(zhì)素酶活力的半定量分析

為初步篩選出纖維素和木質(zhì)素降解能力較強(qiáng)的菌株，采用顯色圈法進(jìn)行了各菌株纖維素酶和木質(zhì)素酶活力的初步分析，結(jié)果如圖1所

示。秸稈中纖維素的比例最高，其次為木質(zhì)素和半纖維

素，但是纖維的微觀結(jié)構(gòu)則是成束的纖維素被包在半纖維素和木質(zhì)素的包層中間。如需將秸稈中的纖維素降解為小分子糖類以供青貯微生物發(fā)酵的進(jìn)行，則需要具有較高木質(zhì)素酶活的菌株完成木質(zhì)素的降解，以充分暴露纖維素[6]。通過以上試驗發(fā)現(xiàn)，不同菌株間纖維素酶和木質(zhì)素酶的活力存在較大差異。從適宜秸稈發(fā)酵的角度來看，首先從28株靈芝菌種中排除木質(zhì)素酶活較低的9株菌，并在剩余的19株菌中選取纖維素酶活較高的9株菌進(jìn)行后續(xù)的纖維素酶和木質(zhì)素酶活力的定量分析。經(jīng)過初步篩選可知，纖維素酶和木質(zhì)素酶活力較高的菌株為南靈一號、黑芝、云芝、G8、日本赤芝、美國靈芝、日本平芝、盆芝、大靈芝，并繼續(xù)以鳳尾為對照，進(jìn)行后續(xù)的纖維素外切酶、纖維素內(nèi)切酶、過氧化物酶、漆酶、錳過氧化物酶活力的定量分析。

2.2纖維素酶和木質(zhì)素酶活力的定量分析

通過對篩選出的9株菌的纖維素酶和木質(zhì)素酶活力進(jìn)行測定，發(fā)現(xiàn)各菌株的不同酶類間的活力也存在較大差異，結(jié)果如表1所示。

由于產(chǎn)酶培養(yǎng)基中添加了秸稈粉，有利于考察各菌株秸稈利用的能力。在以秸稈為纖維素和木質(zhì)素來源的培養(yǎng)基中，云芝、日本平芝和黑芝表現(xiàn)出較強(qiáng)的木質(zhì)素降解能力，其他菌株的木質(zhì)素酶活力較低，有些酶的活力低于檢測靈敏限。從纖維素降解能力來看，盡管南靈一號和大靈芝與云芝、日本平芝和黑芝相比具有更強(qiáng)的纖維素降解能力，但其木質(zhì)素酶活力相對較低，對木質(zhì)素的降解能力有限，會限制秸稈發(fā)酵過程中纖維素的降解與利用。具有較高木質(zhì)素酶活力的云芝、日本平芝和黑芝則可以更好地分解秸稈，一方面可以為發(fā)酵體系中微生物的生長提供更好的碳源，另一方面也更利于動物對纖維的消化。

從纖維素的水解方式來看，由于纖維素屬于大分子糖類，較高的內(nèi)切酶活力更容易將大分子打斷成小分子，增加外切酶的作用位點，可以獲得更好的水解效果，因此通過比較云芝、日本平芝和黑芝的纖維素內(nèi)切酶和外切酶活力，選擇內(nèi)切酶活力較高的黑芝進(jìn)行秸稈發(fā)酵的初步試驗。

2.3青貯飼料的質(zhì)量分析

青貯飼料是在密封環(huán)境下完成乳酸發(fā)酵獲得的，其品質(zhì)要求pH降至4.2以下，并能保持較好的穩(wěn)定性，因此pH和乳酸是青貯飼料品質(zhì)評價的基本指標(biāo)。靈芝是好氧菌，可以迅速消耗密封環(huán)境中的氧氣，促進(jìn)乳酸發(fā)酵的起始。由表2可知，接種組的秸稈發(fā)酵1 d后，樣品中的乳酸產(chǎn)量較對照組顯著提高（P<0.05），體系的pH也發(fā)生顯著下降（P<0.01），且黑芝較血芝的變化明顯。發(fā)酵第2天，對照組也進(jìn)入?yún)捬醢l(fā)酵階段，靈芝輔助發(fā)酵處理組的pH和乳酸產(chǎn)量與對照組不存在顯著差異。發(fā)酵45 d后，靈芝接種組的pH較對照組低，接種黑芝的樣品pH已降至4.2以下，達(dá)到了青貯飼料的成品要求，且對應(yīng)樣品中的乳酸水平也較對照組顯著提高（P<0.05）。

3討論與結(jié)論

青貯飼料作為家畜冬季青綠飼料的重要來源，不僅可以為家畜提供具有良好營養(yǎng)和口感的飼料，而且可以解決大量作物秸稈廢棄物帶來的環(huán)境問題。為進(jìn)一步改善青貯飼料的口感和營養(yǎng)，越來越多的研究將重點放在青貯添加劑上，特別是特殊菌群的添加。筆者篩選出具有較高木質(zhì)素酶和纖維素酶活力的靈芝菌株，進(jìn)行青貯飼料的發(fā)酵，獲得了較理想的青貯飼料成品。

青貯飼料的發(fā)酵分為2個階段：第1階段為耗氧發(fā)酵階段，體系中的微生物通過生長代謝，消耗氧氣；第2階段為厭氧發(fā)酵階段，氧氣耗凈后體系進(jìn)入以乳酸發(fā)酵為主的青貯主發(fā)酵階段[3]。該試驗過程中添加活的靈芝菌，在發(fā)酵的前期通過降解秸稈進(jìn)行生長，生長過程中消耗氧氣，從而縮短了耗氧發(fā)酵的周期，使發(fā)酵過程提前進(jìn)入乳酸發(fā)酵階段，同時為乳酸菌的生長保留更多可利用的營養(yǎng)物質(zhì)；在發(fā)酵過程中，靈芝還可以代謝產(chǎn)生纖維素酶和木質(zhì)素酶，通過降解植物纖維成分提供糖類物質(zhì)，促進(jìn)體系中有益菌的生長，且不會產(chǎn)生其他真菌發(fā)酵產(chǎn)生的霉味。該試驗結(jié)果表明，采用具有較高木質(zhì)素酶和纖維素酶活力的黑芝輔助發(fā)酵，1 d后即可檢測到乳酸發(fā)酵產(chǎn)物，45 d即可達(dá)到青貯飼料的品質(zhì)要求，縮短了常規(guī)需要60 d的發(fā)酵過程。

此外，靈芝還具有很多活性代謝產(chǎn)物，可以從多個方面來提高青貯飼料的品質(zhì)，如靈芝發(fā)酵產(chǎn)物靈芝多糖具有抑制芽孢菌生長的活性[8]，可以減少發(fā)酵過程中芽孢菌生長引起2次發(fā)酵而產(chǎn)生的不良?xì)馕叮梢砸种撇糠置咕纳L，提高青貯飼料的開口穩(wěn)定性；靈芝本身可代謝產(chǎn)生靈芝多糖及靈芝三萜類成分[9]，提高飼喂動物的免疫力，從而減少動物疾病的發(fā)生等。該研究僅初步確定了靈芝輔助發(fā)酵青貯飼料的菌株，后續(xù)將繼續(xù)進(jìn)行靈芝輔助發(fā)酵對發(fā)酵體系微生物菌群的影響，及靈芝青貯飼料對動物免疫力的影響等相關(guān)試驗，完成對靈芝輔助發(fā)酵青貯飼料的產(chǎn)品開發(fā)。

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