Gab2在卵巢癌中的表達及其與鉑類藥物化療耐藥的相關性研究

馮 敏，邢人鑫，邢 薇，茍元彬，李光志

(四川省醫學科學院/四川省人民醫院城東病區婦產科，成都 610101)

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Gab2在卵巢癌中的表達及其與鉑類藥物化療耐藥的相關性研究

馮 敏，邢人鑫△，邢 薇，茍元彬，李光志

(四川省醫學科學院/四川省人民醫院城東病區婦產科，成都 610101)

目的 通過檢測Gab2在卵巢癌中的表達，探討其與卵巢癌鉑類化療耐藥的相關性。方法 利用免疫組織化學及蛋白質印跡法(Western blotting)對該院婦產科2011年1月至2015年6月手術切除的107例患者漿液性卵巢癌組織、12例膀胱癌根治術中切除正常卵巢組織中Gab2的表達進行檢測，分析Gab2表達與臨床分期，以及與以鉑類藥物為基礎的聯合化療療效的相關性。結果 卵巢癌組織中Gab2表達水平明顯高于正常卵巢組織，且與腫瘤的國際婦產科聯盟(FIGO)臨床分期有關，分期越晚表達越高，差異均有統計學意義(P<0.05)；61例卵巢癌患者化療敏感，46例發生耐藥，化療耐藥患者Gab2表達水平明顯高于化療敏感者，差異有統計學意義(P<0.05)。結論 Gab2可能成為預測鉑類藥物化療敏感性的有效指標之一。

卵巢腫瘤；Gab2；順鉑；耐藥

卵巢癌致死率在婦科惡性腫瘤中高居首位，全球每年死于卵巢癌的患者約14萬例[1]。卵巢癌極高致死率的重要原因之一是其早期診斷困難，確診時多為晚期，難以徹底手術清除癌灶。以鉑類藥物為基礎的聯合化療是晚期卵巢癌的一線治療方式，但多數患者在化療過程中產生耐藥，腫瘤復發并出現惡性進展，導致臨床預后不良[2]。因此,通過對卵巢癌耐藥相關因素的分析,探索參與腫瘤耐藥發生的分子，為臨床化療藥物的選擇提供參考，是當前亟待研究的重要課題。磷脂酰肌醇3激酶/絲氨酸蘇氨酸蛋白激酶(PI3K/Akt)信號通路是體內重要的細胞生存通路，主要發揮促進細胞增殖和抗細胞凋亡作用。在惡性腫瘤中，PI3K/Akt信號通路活性顯著增高，在腫瘤發生、增殖、侵襲、轉移及放化療抵抗等生物學行為中發揮重要作用[3]。順鉑等化療藥物的重要作用機制之一即通過抑制PI3K/Akt活性，抑制腫瘤生長、侵襲等。對卵巢癌的大量研究證實，PI3K/Akt信號通路異常活化與卵巢癌化療耐藥密切相關[4]。Grb2相關結合蛋白2(Grb2-associated binding protein 2，Gab2)作為細胞信號通路中一種重要的連接蛋白，通過調節PI3K/Akt等信號通路，在腫瘤生長、分化、遷移和凋亡中發揮重要作用[5-6]。在卵巢癌中Gab2表達是否與鉑類藥物化療耐藥相關目前尚不清楚。本研究通過檢測卵巢癌組織中Gab2的表達，結合患者化療效果，比較分析Gab2蛋白與化療耐藥的關系。

1 資料與方法

1.1 一般資料 標本來自本院婦產科2011年1月至2015年6月手術切除的卵巢組織。其中經術后病理證實為漿液性卵巢癌的患者共107例，年齡31～77歲，平均(51.5±11.3)歲；國際婦產科聯盟(FIGO)臨床分期：Ⅰ～Ⅱb期22例，Ⅲa～Ⅲc 期58例，Ⅳ期27例。術后患者接受紫杉醇+順鉑(TP)方案化療6～8個周期，并進行隨訪觀察及療效評價。鉑類化療敏感和鉑類化療耐藥分組標準參照美國婦科腫瘤學組(GOG)分型：化療敏感為無病間隔至少超過6個月者；耐藥為無病間隔小于6個月者[7]。另取本院膀胱癌根治術中切除的12例患者卵巢組織，術后病理證實為正常標本作為對照組。臨床標本獲取在患者知情同意并經院醫學倫理委員會批準下進行。標本分別以甲醛固定后常規石蠟包埋存檔及液氮凍存。

A：正常卵巢組織；B：Ⅰ～Ⅱb期卵巢癌；C：Ⅲa～Ⅲc期卵巢癌：D：Ⅳ期卵巢癌

圖1 免疫組織化學檢測Gab2在正常及漿液性卵巢癌組織內的表達(×200)

1.2 主要試劑 一抗為兔抗人Gab2多克隆抗體購自美國Epitomics公司，兔抗人β-actin多克隆抗體、山羊抗兔IgG-HRP二抗均購自美國Thermo公司。免疫組織化學試劑盒[鏈霉菌抗生物素蛋白-過氧化物酶連接(SP)法]、二氨基聯苯胺(DAB)顯色試劑盒、蘇木精均購自北京中杉金橋生物技術公司。

1.3 方法

1.3.1 免疫組織化學 檢測組織內Gab2表達，免疫組織化學步驟按照試劑盒說明書操作。一抗工作濃度1∶200，用磷酸鹽緩沖液(PBS)代替一抗作為陰性對照。二甲基聯苯胺(DAB)顯色劑顯色后，蘇木精復染，中性樹膠封片，顯微鏡下觀察結果。結果判定采用Fromowitz綜合計分法，染色強度評分：染色呈淡黃色顆粒，染色明顯高于背景，染色呈淺棕黃色顆粒，以及出現大量深棕黃色顆粒分別評為0、1、2、3分；陽性細胞數評分：每片觀察10個高倍視野，染色陽性細胞數/100小于5%、5%～<26%、26%～<51%、51%～75%或大于75%分別評為0、1、2、3、4分。染色強度評分與陽性細胞數評分之和小于2分判為陰性(-)，2～3分判為弱陽性(1+)，4～5分判為中度陽性(2+)，6～7分判為強陽性(3+)。

1.3.2 蛋白質印跡法(Western blotting) 檢測組織內Gab2蛋白表達，于200 mg組織標本加入1 mL裂解液，勻漿提取總蛋白，二喹啉甲酸(BCA)法測定蛋白水平后-70 ℃保存備用。取20 μg總蛋白十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)凝膠上樣，蛋白電泳分離后轉移至聚偏氟乙烯(PVDF)膜。5%脫脂奶粉室溫封閉1 h，1∶200稀釋的Gab2及1∶500稀釋的β-actin一抗孵育，4 ℃過夜，Tris緩沖生理鹽水吐溫(TBST)洗膜后置于二抗(1∶1 000)，室溫孵育1 h，TBST洗膜后DAB顯色成像。目的條帶與相應的β-actin條帶灰度值比值代表Gab2相對表達水平。

2 結 果

2.1 Gab2表達與卵巢癌病理分期的關系 Gab2主要表達于細胞質，在細胞核少量表達，正常卵巢組織內表達呈弱陽性或陰性，腫瘤組織內表達明顯升高，見圖1。Gab2表達水平與腫瘤的FIGO臨床分期有關，分期越晚表達越高，差異均有統計學意義(P<0.05)，見圖2。

2.2 Gab2表達與卵巢癌化療療效的關系 107例卵巢癌患者接受TP方案化療，療效評價結果：61例化療敏感，取得臨床緩解，46例發生耐藥。化療耐藥患者Gab2表達水平高于化療敏感患者，差異有統計學意義(P<0.05)，見圖3。

*：P<0.05，與對照組比較；#：P<0.05，與Ⅰ～Ⅱb期卵巢癌比較；△：P<0.05，與Ⅲa～Ⅲc期卵巢癌比較

圖2 Western blotting檢測Gab2蛋白在正常及漿液性卵巢癌組織內的表達

*：P<0.05，與敏感患者比較

圖3 Western blotting檢測Gab2蛋白在TP化療敏感組與耐藥組的表達情況

3 討 論

以鉑類藥物為基礎的聯合化療是治療卵巢癌，尤其是晚期卵巢癌的重要手段，而腫瘤細胞對化療產生耐藥，嚴重影響了卵巢癌患者的遠期療效和總體生存率。15%～25%的卵巢癌患者對以鉑類為基礎的聯合化療方案原發耐藥，而80%以上患者發生繼發性鉑類耐藥。化療耐藥是導致卵巢癌患者5年生存率低(20%～30%)的主要因素[7]。化療耐藥的相關機制尚不清楚，目前認為它是多因素、多水平、多基因參與的復雜過程，其中涉及藥代動力學、藥物作用靶點、DNA損傷修復系統、細胞凋亡調控、腫瘤微環境、細胞外信號轉導通路、微RNA、腫瘤干細胞及上皮間質轉化等[8-9]。

Gab2是Gabs家族蛋白中一種至關重要的信號中介分子，該家族蛋白通過接受多種生長因子、細胞因子及抗原等細胞外刺激，參與信號轉導的放大及整合。Gab2蛋白被蛋白酪氨酸激酶磷酸化激活后，招募富含SH2結構域的信號效應蛋白如SHP2、PI3K的p85亞基、Crk和GC-GAP，進而參與多種信號轉導途徑，如PI3K/AKT、SHP2/細胞外信號調節激酶(ERK)及Janus激酶/信號轉導和轉錄激活子(JAK/STAT)等，在腫瘤細胞增殖、分化、凋亡及遷移等生理過程中發揮重要作用[5-6]。Wang等[10]發現在卵巢癌細胞內Gab2的mRNA及蛋白過表達。通過激活PI3K/Zeb1通路，過表達的Gab2蛋白正向調控E-cadherin的表達，進而增強卵巢癌細胞的遷移和侵襲能力。相反，沉默Gab2將反向調節E-cadherin的表達，從而抑制卵巢癌細胞的遷移及侵襲能力。Dunn等[11]也認為，Gab2可以作為卵巢癌的一種致癌基因活化PI3K信號途徑，在誘導卵巢癌細胞轉變中發揮重要作用。最新研究發現，Gab2可作為結腸癌及神經膠質瘤患者獨立的預后指標。在結腸癌患者中，Gab2過表達與腫瘤預后不良密切相關[12]。而在神經膠質瘤，Gab2表達水平與患者生存期呈負相關[13]。Davis等[14]也報道，在高度惡性漿液性卵巢癌患者中，腫瘤組織內Gab2表達與PI3K/mTOR抑制劑PF-04691502靶向治療的敏感性密切相關。然而，目前尚不清楚Gab2分子與卵巢癌患者鉑類藥物化療耐藥是否相關。

本研究通過檢測Gab2蛋白在不同分期的卵巢癌組織中的表達情況，并跟蹤隨訪研究對象規范化療后的耐藥狀況，探討Gab2與化療耐藥的關系。結果顯示，Gab2蛋白表達與卵巢癌化療效果關系密切，在耐藥組患者的腫瘤組織內，Gab2表達明顯增強。由此認為，Gab2可以作為預測卵巢癌化療療效的有用指標，對卵巢癌臨床化療用藥提供指導，以改善卵巢癌患者預后。

[1]Jayson GC，Kohn EC，Kitchener HC，et al．Ovarian cancer[J]．Lancet，2014，3849(9951)：1376-1388．

[2]Davis A，Tinker AV，Friedlander M．"Platinum resistant" ovarian cancer:what is it,who to treat and how to measure benefit?[J]．Gynecol Oncol，2014，133(3)：624-631．

[3]Polivka J Jr，Janku F．Molecular targets forcancertherapy in thePI3K/AKT/mTOR pathway[J]．Pharmacol Ther，2014，142(2)：164-175．

[4]Mor G，Montagna MK，Alvero AB．Modulation of apoptosis to reverse chemoresistance[J]． Methods Mol Biol，2008，414：1-12．

[5]Adams SJ，Aydin IT，Celebi JT．GAB2--a scaffolding protein in cancer[J]．MolCancer Res，2012，10(10)：1265-1270．

[6]Ding CB，Yu WN，Feng JH，et al．Structure and function of Gab2 and its role in cancer(Review)[J]．Mol Med Rep，2015，12(3)：4007-4014．

[7]Harter P，Hilpert F，Mahner S，et al．Systemic therapy in recurrent ovarian cancer:current treatment options and new drugs[J]．Expert Rev Anticancer Ther，2010，10(1)：81-88．

[8]Wiedemeyer WR，Beach JA，Karlan BY．Reversingplatinum resistance in high-grade serousovariancarcinoma:targeting BRCA and the homologous recombination system[J]．Front Oncol，2014，4：34．

[9]Ali AY，Farrand L，Kim JY，et al．Molecular determinants ofovarian cancerchemoresistance:new insights into an old conundrum[J]．Ann N Y Acad Sci，2012，1271：58-67．

[10]Wang Y，Sheng Q，Spillman MA，et al．Gab2 regulates the migratory behaviors and E-cadherin expression via activation of the PI3K pathway in ovarian cancer cells[J]．Oncogene，2012，31(20)：2512-2520．

[11]Dunn GP，Cheung HW，Agarwalla PK，et al．In vivo multiplexed interrogation of amplified genes identifies GAB2 as an ovarian cancer oncogene[J]．Proc Natl Acad Sci U S A，2014，111(3)：1102-1107．

[12]Ding C，Luo J，Yu W，et al．Gab2is a novel prognostic factor for colorectalcancerpatients[J]．Int J Clin Exp Pathol，2015，8(3)：2779-2786．

[13]Liu H，Li G，Zeng W，et al．Combined detection of Gab1 andGab2expression predicts clinical outcome of patients with glioma[J]．Med Oncol，2014，31(8)：77．

[14]Davis SJ，Sheppard KE，Anglesio MS，et al．Enhanced GAB2 expression is associated with improved survival in high-grade serous ovarian cancer and sensitivity to PI3K inhibition[J]．Mol Cancer Ther，2015，14(6)：1495-1503．

Correlation between Gab2 expression in ovarian cancer and resistance to platinum drugs chemotherapy

FengMin，XinRenxin△，XinWei，GouYuanbin，LiGuangzhi

(DepartmentofGynaecologyandObstetrics,ChengdongBranch,SichuanProvincialAcademyofMedicalSciences/SichuanProvincialPeople′sHospital,Chengdu,Sichuan610101,China)

Objective To investigate the correlation between Gab2 expression and platinum drugs chemotherapy resistance by detecting the expression of Gab2 in ovarian cancer.Methods Immunohistochemical and Western blotting techniques were used to detect the expression of Gab2 in 107 specimens of serous ovarian tumor tissue and 12 specimens of normal ovarian tissues resected during bladder cancer radical operation in the department of gynaecology of our hospital from January 2011 to June 2015.The correlation between Gab2 expression with clinical stage and effect of combined chemotherapy based on platinum drugs was analyzed.Results The Gab2 expression level in ovarian cancer tissue was significantly higher than that in normal ovarian tissue,moreover had a relation with the FIGO clinical stage,the expression level of Gab2 increased with the increase of clinical stage,the difference was statistically significant (P<0.05);61 cases were sensitive to chemotherapy,46 cases were resistant to chemotherapy,the Gab2 expression level in the patients with chemotherapy resistance was significantly higher than that in the patients with chemotherapy sensitivity,the difference was statistically significant (P<0.05).Conclusion Gab2 may become one of effective indexes for predicting platinum drugs chemotherapy sensitivity.

ovarian neoplasms；Gab2；cisplatin；drug resistance

馮敏(1980-)，主管護師，本科，主要從事卵巢癌鉑類藥物化療耐藥相關性方面的研究。

△通信作者，E-mail:ashman83@163.com。

10.3969/j.issn.1671-8348.2017.21.015

R737.31

A

1671-8348(2017)21-2931-03

2017-02-10

2017-04-15)