腎細胞癌中DACT2基因啟動子區甲基化狀態與mRNA表達的研究

樊 博，齊 盼，張愛莉，趙志紅，倪曉辰，劉 彬，馬永良，任宗濤

(河北醫科大學第四醫院泌尿外科，石家莊 050000)

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腎細胞癌中DACT2基因啟動子區甲基化狀態與mRNA表達的研究

樊 博，齊 盼，張愛莉△，趙志紅，倪曉辰，劉 彬，馬永良，任宗濤

(河北醫科大學第四醫院泌尿外科，石家莊 050000)

目的 探討DACT2基因在腎細胞癌(RCC)發生、發展中的作用。方法 收集該院2014年8月至2015年8月59例住院RCC患者腎癌根治術后RCC及相應癌旁組織、正常組織標本，分別應用甲基化特異性PCR(MSP)、實時熒光定量PCR(RT-PCR)法檢測其DACT2基因甲基化狀態、mRNA表達情況，應用免疫組織化學過氧化酶標記的鏈霉卵白素(SP)法檢測其細胞質內β-catenin蛋白的表達，并分析RCC組織DACT2基因甲基化狀態及mRNA表達與臨床病理特征的關系，以及DACT2基因甲基化與mRNA及β-catenin表達的關系。結果 RCC組織中DACT2 mRNA相對表達水平(0.427±0.025)明顯低于癌旁組織(0.801±0.047)和正常組織(0.872±0.022)，RCC組織中DACT2基因甲基化陽性率(45.76%)明顯高于癌旁組織(6.78%)及正常組織(5.08%)，差異均有統計學意義(P<0.05)，而癌旁組織與正常組織比較差異均無統計學意義(P>0.05)。在RCC組織中DACT2基因mRNA相對表達水平及啟動子區甲基化發生率與患者的年齡、性別、腫瘤大小、臨床分期、Fuhrman分級等臨床資料間均無明顯相關性(P>0.05)。甲基化組中DACT2基因的mRNA相對表達水平低于非甲基化組，差異有統計學意義(P<0.05)。RCC組織中β-catenin蛋白在細胞質中的表達率高于癌旁組織和正常組織，差異有統計學意義(P<0.05)，且DACT2基因甲基化與β-catenin蛋白表達呈正相關(r=0.324，P=0.012)。結論 DACT2基因啟動子區甲基化及其mRNA相對表達水平降低可能參與RCC的發生，但與RCC的臨床進展無關，DACT2基因啟動子區發生甲基化可能是引起其mRNA相對表達降低的原因之一，且腎癌組織DACT2基因甲基化的發生可能與β-catenin的高表達有關。

腎腫瘤；DACT2；啟動子；甲基化；RNA，信使

表1 RT-PCR及MSP引物序列及反應條件

DACT家族基因是近年來研究較多的一種新的信號通路調控因子，其主要通過對Wnt/β-catenin信號傳導通路進行負調控來抑制腫瘤的形成。近年來也有研究表明，由于DACT2基因啟動子區發生甲基化導致其表達失活，在肝癌、胃癌、食管癌、乳頭狀甲狀腺癌及結腸癌等惡性腫瘤的發生中起著重要的作用。然而，DACT2基因在腎細胞癌(renal cell carcinoma，RCC)中的功能及其相應的表觀遺傳學作用尚未見報道。本研究提取59例RCC患者術后所得正常腎組織、癌旁組織及癌組織的RNA與DNA，應用實時熒光定量PCR(RT-PCR)檢測DACT2基因mRNA的相對表達水平，并應用甲基化特異性PCR(MSP)技術對DACT2基因啟動子甲基化狀態進行檢驗。此外，本研究還通過分析各組織中DACT2基因mRNA相對表達水平及其啟動子區甲基化狀態與臨床資料之間的關系，并結合免疫組織化學方法檢測其在腎癌組織、癌旁及正常組織中的表達情況，并進行相應統計學分析，以進一步揭示RCC的發病機制，為RCC的早期發現、診治與預后的判斷提供相應的理論基礎。

1 資料與方法

1.1 一般資料 收集2014年8月至2015年8月本院泌尿外科59例住院患者腎癌根治術后標本，術后病理結果均確診為RCC。其中男36例，女23例；年齡24～82歲，中位年齡為61歲；術前均未接受放、化療；根據1997年世界衛生組織(WHO)推薦Fuhrman分級：高分化34例，中分化18例，低分化7例；按照2002年美國腫瘤研究聯合會(AJCC)分期標準分為：Ⅰ期42例，Ⅱ期14例，Ⅲ+Ⅳ期3例。每例患者術后均取癌組織、癌旁組織(距癌組織2 cm處)與正常組織標本3份。

1.2 主要儀器與試劑 蛋白酶K(上海生工生物公司)、TRNzol(天根生化科技有限公司)、互補DNA(cDNA)第一鏈合成試劑盒(天根生化科技有限公司)、DNA重亞硫酸鹽轉化試劑盒(天根生化科技有限公司)、MSP試劑盒(天根生化科技有限公司)、藍色體系(康為世紀有限公司)、RT-PCR引物(北京六合華大基因)、MSP引物(上海生工生物公司)、β-catenin鼠單克隆抗體(北京中衫金橋生物技術有限公司)，鼠二抗免疫組化試劑盒[通用型Biotin鏈霉卵白素-辣根過氧化物酶復合物(SP-HRP)免疫組織化學試劑盒，北京中衫金橋生物技術有限公司]。

1.3 方法

1.3.1 RT-PCR檢測DACT2 mRNA的表達 標本提取后及時按TRIzol試劑說明書提取總RNA，并參照反轉錄試劑盒(cDNA第一鏈合成試劑盒)說明書的比例加樣，將RNA反轉錄成cDNA保存于-80 ℃冰箱備用。三磷酸甘油醛脫氫酶(GAPDH)作為內參照，引物及退火溫度見表1。將PCR產物進行2%瓊脂糖凝膠電泳，采用Gelwork22 ID軟件，對電泳圖像中DACT2的表達進行半定量。以DACT2條帶的吸光度(A)值與GAPDH條帶的A值的比值作為DACT2基因的相對表達量。

1.3.2 MSP檢測DACT2基因的甲基化狀態 酚/氯仿抽提法提取癌組織、癌旁組織及正常組織組基因DNA。參照DNA重亞硫酸鹽轉化試劑盒說明書的比例加樣，經亞硫酸氫鹽處理后，DNA中的C轉變為U，而基因的CpG島發生甲基化后，則不能發生這種改變，根據此原理設計相應的甲基化和非甲基化引物，檢測該基因是否發生甲基化。具體引物序列及退火溫度見表1。擴增產物經2%瓊脂糖凝膠電泳，用凝膠電泳成像及圖像分析系統進行圖像分析。MSP陽性對照采用健康人外周血淋巴細胞DNA，經CpG甲基轉移酶處理后進行PCR，陰性對照用滅菌雙蒸水取代DNA模板進行PCR。

1.3.3 免疫組織化學法檢測β-catenin的表達 β-catenin采用常規SP法。4 μm組織切片常規脫蠟至水，3%過氧化氫甲醇室溫孵育20 min；pH 8.0乙二胺四乙酸(EDTA)高壓鍋抗原修復2 min，蒸餾水洗滌，磷酸鹽緩沖液(PBS)浸泡5 min，2次，其后的試驗步驟按SP試劑盒說明書進行，二氨基聯苯胺(DAB)顯色，蘇木精復染，常規梯度乙醇脫水、二甲苯透明、中性樹膠封片，顯微鏡下觀察。設PBS代替一抗為空白對照，己知陽性片作陽性對照，作為質量控制標準。

2 結 果

2.1 RCC中DACT2 mRNA表達 檢測59例RCC組織及相應的癌旁及正常組織中DACT2 mRNA表達情況，見圖1。DACT2 mRNA在RCC和癌旁及正常組織中的相對表達水平分別為0.427±0.025、0.801±0.047、0.872±0.022。RCC組織中DACT2 mRNA相對表達水平明顯低于癌旁組織和正常組織，差異有統計學意義(P<0.05)。在RCC患者中，DACT2 mRNA表達與患者的臨床分期及腫瘤的組織分化程度、年齡、性別、腫瘤大小等均無相關性(P>0.05)，見表2。

A：正常組織；B：RCC組織

圖1 正常及RCC組織中β-catenin蛋白免疫組織化學結果(IHC×200)

2.2 RCC中DACT2基因甲基化狀態 DACT2基因在檢測的59例患者RCC組織及相應的癌旁及正常組織中甲基化發生率分別為45.76%(27/59)，6.78%(4/59)，5.08%(3/59)。RCC組織中DACT2基因甲基化陽性率明顯高于癌旁組織及正常組織(P<0.05)。癌旁組織及正常組織中DACT2基因甲基化發生率比較，差異無統計學意義(P>0.05)。在RCC組織中DACT2基因啟動子區甲基化的發生率與患者的年齡、性別、腫瘤大小、臨床分期、Fuhrman分級(組織學分級)等臨床資料間均無明顯相關性(P>0.05)，見表3。

表2 RCC組織中DACT2 mRNA表達與患者臨床病理特征的關系(n)

表3 RCC組織中DACT2 甲基化狀態與患者臨床病理特征的關系(n)

2.3 RCC組織中DACT2基因甲基化發生率與mRNA相對表達水平的關系 59例患者RCC組織中甲基化者DACT2基因的mRNA相對表達水平(0.405±0.014)明顯低于非甲基化者(0.445±0.015)，差異有統計學意義(t=-10.868，P=0.000)。

2.4 RCC中β-catenin的表達 β-catenin在正常腎小管上皮細胞細胞質低表達或不表達；在腎癌中細胞質高表達或蓄積(圖1)。在RCC組織中的陽性表達率為77.97%(46/59)，明顯高于癌旁15.25%(9/59)及正常組織11.86%(7/59)，差異有統計學意義(P<0.05)。進一步分析DACT2基因甲基化狀態與β-catenin表達間的關系，在DACT2基因甲基化陽性的RCC組織中，其β-catenin表達率為 92.59%(25/27)，經Spearman等級相關分析，二者呈明顯正相關(r=0.324，P=0.012)，見表4。

表4 腎癌組織中DACT2基因甲基化與β-catenin蛋白表達的關系

3 討 論

惡性腫瘤是在內部和外部多種因素共同作用下，使某些細胞在基因水平上喪失正常的生長調控功能，導致細胞的異常生長及分化而發生的。因此，從本質上講惡性腫瘤是一種基因病。隨著人類基因組學研究的不斷深入，1939年有研究者提出了表觀遺傳學的概念。表觀遺傳學是一門研究DNA序列不變而其基因表達發生可遺傳改變的遺傳學分支學科[1]。其參與細胞調控的主要形式為：DNA核苷酸胞嘧啶的甲基化修飾、組蛋白修飾、非編碼RNA干擾的調節等。目前科學家們認為，DNA甲基化和組蛋白修飾是最常見的兩種關系到基因調控和細胞癌變的表觀遺傳學事件[2]。近年來已有大量的文獻報道稱，抑癌基因啟動子區異常甲基化是腎癌發生的重要原因之一。抑癌基因啟動子區的CpG島發生甲基化后，會導致抑癌基因表達沉默失活，進而影響細胞正常的生長調控，細胞過度增殖最終導致腫瘤的發生[3]。國外已有報道稱，抑癌基因的異常甲基化可視為一種有效診斷癌癥的分子標記物。同時有研究發現，體外給予去甲基化藥物后能夠改變一些惡性腫瘤的病理生理學行為。這表明抑癌基因啟動子區CpG島的異常甲基化狀態與惡性腫瘤的發生有關，給予相應的去甲基化治療，去除其CpG島的異常甲基化狀態具有治療惡性腫瘤的潛能[4]。

DACT2基因位于人類染色體6q27。近年來，眾多研究表明，DACT2基因在肝癌、肺癌、食管鱗狀癌及乳頭狀甲狀腺癌等許多癌癥中均表達下調[5-9]。同時DACT2基因啟動子區高度甲基化也是引起甲狀腺乳頭狀癌發生轉移的重要原因之一[7]。本研究結果表明，在59例RCC患者的3種不同組織中，其RCC組織的DACT2基因啟動子區甲基化的發生率明顯高于癌旁組織和正常腎組織。同時發現，RCC組織中DACT2基因mRNA的相對表達水平低于癌旁組織和正常腎組織。進一步比較發現，發生甲基化的RCC組織中DACT2基因mRNA的相對表達水平低于未發生甲基化的RCC組織。進一步研究發現，在RCC組織中DACT2基因的高甲基化率與β-catenin蛋白在細胞質中的高表達呈明顯正相關。由此推斷DACT2可能通過β-catenin起作用，β-catenin功能異常是導致細胞向癌變方向發展的原因之一。

綜上所述，本研究顯示DACT2基因啟動子區異常甲基化可能會導致DACT2基因的表達下降，且二者的發生均與RCC的發生有關，但二者發生與RCC的臨床進展未見明顯相關。筆者認為可以進一步研究給予去甲基化藥物物后，RCC細胞系中DACT2基因表達的恢復情況及RCC細胞系的變化情況，以期進一步探討DACT2基因與RCC發生、發展的關系，為RCC的發病機制提供更深入的理論依據。同時，為RCC的早期診斷與治療提供一個可能的生物學標志。

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DACT2 gene promoter area methylation status and mRNA expression in renal cell carcinoma

FanBo，QiPan，ZhangAili△，ZhaoZhihong，NiXiaochen，LiuBin，MaYongliang，RenZongtao

(DepartmentofUrologySurgery,FourthHospitalofHebeiMedicalUniversity,Shijiazhuang,Hebei050000,China)

Objective To explore the role of the DACT2 gene in the occurrence and development of renal cell carcinoma(RCC).Methods The samples of RCC tissues and corresponding tumor-adjacent tissues after radical operation and normal kidney tissues were collected.The methylation specific PCR (MSP) and real time fluorescence reverse transcriptase-PCR (RT-PCR) methods were adopted to detect the methylation status and mRNA expression of DACT2.The streptavidin-peroxidase (SP) method labeled by immunohistochemistry peroxidase was used to examine the expression of β-catenin protein.Then the relationship between DACT2 gene methylation status and mRNA expression with the clinicopathologic characteristics was analyzed.The relationship between DACT2 gene methylation with mRNA and β-catenin expression was analysed,as well.Results The DACT2 mRNA relative expression level in RCC tissues was 0.427±0.025,which was significantly lower than (0.801±0.047) in tumor-adjacent tissues and (0.872±0.022) in normal tissue,the positive rate of DACT2 gene methylation in RCC tissues was 45.76%,which was significantly higher than 6.78% in tumor-adjacent tissues and 5.08% in normal tissues,the difference was statistically significant (P<0.05),while the difference between tumor-adjacent tissues and normal tissues had no statistical significance (P>0.05).The DACT2 gene mRNA expression level in RCC tissues and promoter area methylation occurrence rate had no obvious correlation with the clinical data such as patients age,gender,tumor size,clinical stage and Fuhrman grade (P>0.05).The DACT2 gene mRNA relative level in the methylation group was lower than that in the non-methylation group,the difference was statistically significant (P<0.05).The expression rate of β-catenin protein in cytoplasma in RCC tissues was higher than that in the tumor-adjacent tissues and normal tissues,the difference was statistically significant (P<0.05),moreover,DACT2 gen methylation had a positive correlation with β-catenin protein expression (r=0.324，P=0.012).Conclusion The decrease of DACT2 gene promoter area methylation and mRNA relative expression level may participate in the RCC occurrence,but has no relationship with RCC clinical progression.Methylation occurred in DACT2 gene promoter area may be one of reasons causing mRNA relative expression decrase.DACT2 gene methylation occurrence in RCC tissue might be related to the high expression of β-catenin.

kidney neoplasms；DACT2；promoter；methylation；RNA，messenger

樊博(1983-)，主治醫師，碩士，主要從事泌尿系腫瘤方面的研究。

△通信作者，E-mail：z13930409899@163.com。

10.3969/j.issn.1671-8348.2017.21.005

R692.6

A

1671-8348(2017)21-2895-03

2017-02-25

2017-04-30)