下調PI3K/Akt信號通路對抑制喉癌細胞生長的影響*

王慧敏，余文發，周 航，盧振民

(新鄉醫學院第一附屬醫院耳鼻咽喉科，河南衛輝 453100)

?

下調PI3K/Akt信號通路對抑制喉癌細胞生長的影響*

王慧敏，余文發，周 航，盧振民△

(新鄉醫學院第一附屬醫院耳鼻咽喉科，河南衛輝 453100)

目的 探討鉀通道阻斷劑四乙胺(TEA)通過磷脂酰肌醇3激酶(PI3K)/絲氨酸蘇氨酸蛋白激酶(Akt)信號通路對人喉癌上皮細胞(Hep-2)增殖與凋亡的影響。方法 將TEA作用于Hep-2，用噻唑藍(MTT)法測定Hep-2細胞活性，計算出TEA對Hep-2的增殖抑制率；采用Hoechest33258染色檢測細胞凋亡，用流式細胞儀(FCM)法測定Hep-2凋亡率。結果 5、10、20 mmol/L TEA接種后，Hep-2細胞增殖抑制率分別達到12.573%、31.385%和56.132%，Hep-2作用96 h后細胞凋亡率分別為(41.64±2.67)%、(58.76±4.32)%和(72.65±6.54)%，TEA處理組抑制率和凋亡率都高于未用TEA處理的對照組，差異均有統計學意義(P<0.05)。結論 TEA可抑制Hep-2的增殖及體內生長，促進Hep-2的凋亡。

鉀通道阻滯劑；喉腫瘤；上皮細胞；PI3K-Akt；細胞凋亡

University,Weihui,Henan453100,China)

喉癌是一種常見的惡性腫瘤，發病率占全身腫瘤的1%～5%，其病因尚不十分清楚，癥狀因癌腫部位而存在較大差別[1]。探索喉細胞癌發生、發展的病理生理機制，尋找有效的治療方法是腫瘤外科和耳鼻喉科的一個研究熱點。外離子環境是細胞依賴生存的條件，喉癌細胞上存在著多種類型的鉀離子通道，調節磷脂酰肌醇3激酶(PI3K)/絲氨酸蘇氨酸蛋白激酶(Akt)信號通路對咽喉腫瘤細胞的增殖和凋亡有著非常重要的作用[2]。為了探討鉀通道在喉癌細胞增殖中的作用和機制，尋找喉癌治療的新靶點。筆者以體外培養的人喉癌上皮細胞(human larynx carcinoma epithelial cell，Hep-2)為研究對象，觀察鉀通道阻滯劑四乙胺(tetra ethyl ammonium，TEA)對Hep-2細胞增殖和凋亡的影響。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細胞來源 Hep-2細胞株購自中國科學院上海細胞庫。

1.1.2 藥品與試劑 胎牛血清(FBS)購自杭州四季清公司；TEA、Hoechest33258熒光染料、噻唑藍(MTT)、二甲亞砜(DMSO)、胰蛋白酶均購自美國Sigma公司；流式試劑盒購自北京中杉金橋生物技術有限公司。其他試劑均為國產分析醇。

1.1.3 儀器 Olympus-LX70倒置顯微鏡(西安測維光電技術有限公司)；HEAR-cell150培養箱(上海森信實驗儀器有限公司)；ZEISS-imager Al熒光顯微鏡(西安測維光電技術有限公司)；AT-858酶標儀(上海優浦科學儀器有限公司生產)；BD-FACSCalibur流式細胞儀(FCM)。

1.2 方法

1.2.1 細胞株培養 在37 ℃、5% CO2飽和濕度的培養箱中，將所購HEP-2細胞株單層接種在含10% FBS的DMEM培養基中(每100毫升含1萬U的慶大霉素)生長，同時以0.25%胰蛋白酶消化傳代。

1.2.2 細胞生長抑制實驗 采用MTT法，取2×104/mL、生長狀態良好的Hep-2細胞，預培養12 h，細胞貼壁后，設對照組(不給予TEA處理)和不同TEA水平處理組(TEA 1、5、10、20 mmol/L)，分別接種于4塊96孔平底培養板中，每孔100 μL細胞，在37 ℃、體積分數為5%CO2的培養箱中繼續培養24、48、72、96 h，然后棄上清液，每孔加入5 g/L MTT溶液10 μL，37 ℃作用4 h后，每孔再加入100 μL DMSO，震蕩10 min搖勻，酶標儀(λ=490 nm)測吸光度(A)值。整個實驗在同樣條件下重復3次，計算藥物作用后細胞的體外生長抑制率，細胞抑制率(%)=(對照組A值-實驗組A值)/對照組A值×100%。隨后以時間為橫軸，細胞抑制率為縱軸繪制Hep-2的生長抑制率曲線。

1.2.3 細胞凋亡檢測 分別收集被不同TEA水平處理96 h后的Hep-2細胞，用磷酸鹽緩沖液(PBS)洗滌2次(1 000 r/min，5 min)，收集5×105個細胞，加入500 μL的緩沖液懸浮細胞；取0.1 μL細胞懸液涂于蓋玻片上，用新鮮配制1∶3混合的乙酸/甲醇固定液固定10 min，蒸餾水漂洗后，加入8 mg/L Hoechst 33258熒光染色液染色20 min，用雙蒸水洗3次，自然晾干后封片，熒光顯微鏡下觀察細胞形態。凋亡細胞呈染色質高度凝聚、邊集，細胞核裂解為碎塊，凋亡小體形成。室溫下避光反應5～15 min，在FCM上用激發波長Ex=488 nm，發射波長Em=530 nm測試細胞凋亡周期，并計算細胞凋亡率，凋亡率(%)=[實驗組凋亡率(%)-對照組凋亡率(%)]/[1-對照組凋亡率(%)]。

2 結 果

2.1 TEA對Hep-2細胞增殖的抑制效應 MTT實驗結果顯示，對照組A值為0.850±0.015，抑制率為0。接種TEA后(不同TEA水平的處理組)，A值和增殖抑制率隨藥物水平變化而相應變化，TEA為1 mmol/L時，A值和增殖抑制率與對照組很接近；當TEA≥5 mmol/L時，對Hep-2細胞的增殖抑制率明顯高于對照組(P<0.05)，且TEA水平與A值成反比，與增殖抑制率成正比，見表1。處理組4個不同水平TEA培養后，Hep-2細胞的生長抑制率隨著反應時間延長而增高，且TEA水平越高，增幅越大，Hep-2的生長抑制率曲線見圖1。

表1 48 h后TEA對Hep-2細胞增殖抑制作用的影響

*：P<0.01，與對照組比較

圖1 TEA對Hep-2細胞的生長抑制率曲線

2.2 TEA對Hep-2細胞凋亡及周期分布的影響 通過光學顯微鏡下觀察Hep-2的形態，結果顯示：對照組細胞形態良好、細胞膜完整、細胞核大圓、核仁色深，清晰可見，而TEA處理組的Hep-2細胞除很少部分繼續貼壁外，大部分已死亡、脫落，且貼壁細胞也出現圓縮、脫落等凋亡趨勢。Hoechst33258熒光染色觀察顯示，對照組細胞膜完整，細胞質豐富飽滿，細胞核呈現均勻一致的藍色熒光；TEA處理組亮藍色的細胞核質濃縮、密度增加，核聚集并破裂成大小不等的碎片，呈典型的凋亡形態。FCM檢測Hep-2細胞凋亡率比較，見表2。

表2 不同水平的TEA作用96 h后Hep-2細胞周期分布及凋亡率

*：P<0.05：#：P<0.01，與對照組比較

3 討 論

大部分喉癌都屬于鱗癌，目前臨床上對喉癌的治療方式早期主要以放療為主，晚期多采取手術加化療的方式[3]。隨著對人喉癌Hep-2細胞的生物學特性和分子機制研究的不斷深入，利用生物分子學原理，通過阻隔通道、下調環境去抑制癌細胞生長，誘導癌細胞凋亡進行抗腫瘤治療也開始應用到咽喉癌防治中，且成為喉癌防治的新策略[4]。眾多研究發現，PI3Ks信號參與了腫瘤細胞的增殖、分化、調節和凋亡，與其下游分子Akt所組成的信號通路與人類腫瘤的發生、發展、遷移、黏附、腫瘤血管生成及細胞外基質的降解等都有密切的相關性，以PI3K/Akt信號通路關鍵分子為靶點，發展小分子藥物有效抑制該通路的高活性的惡性腫瘤治療策略也在積極探索中[5-6]。

近年有研究發現，鉀離子通道在腫瘤細胞的增殖和凋亡中發揮重要作用，不同腫瘤細胞膜存在多種鉀離子通道，并調控腫瘤細胞生長[7]。如果加入鉀離子通道阻斷劑，可控制腫瘤細胞的通透性、氧耗、核碎，繼而促使癌細胞體積縮小，生理形態發生改變。同時通過P53蛋白殘基磷酸化，下調PI3K/Akt通路活性，抑制腫瘤細胞的生長，減少癌細胞增殖、轉移，促進癌細胞凋亡[8]。為了探討鉀離子通道通過下調PI3K/Akt信號通路對人喉癌上皮細胞的生長抑制作用，本研究以人喉癌上皮細胞Hep-2為研究對象，選擇鉀通道阻滯劑TEA作為工具藥物，觀察PI3K/Akt通路對喉癌上皮細胞細胞黏附、運動和增殖侵襲的影響。MTT法實驗結果表明，接種48 h后，TEA處理組中TEA水平在5、10、20 mmol/L時，對Hep-2細胞增殖抑制率分別達到12.573%、31.385%和56.132%。與對照組比較，差異有統計學意義(P<0.05)，說明TEA對Hep-2細胞有明顯的抑制作用。

采用Hoechst33258熒光染色法和FCM檢測細胞凋亡，顯微鏡觀察發現，藥物水平的增加和作用時間的延長與生長抑制率成正比，即TEA體外抗人喉癌Hep-2細胞的作用具有明顯的量效關系和時效關系。通過FCM檢測，可以看出S期細胞明顯減少，細胞被阻滯于G0/G1期。喉癌細胞具有多種抑制凋亡、延長存活的機制，TEA處理有助于下調P13K/Akt信號通路[9]，通過TEA對Akt進行磷酸化，繼而對Hep-2形成細胞周期阻滯，使G1期細胞不能正常通過細胞周期點進入S期而發生G0/G1期阻滯，這正是一種顯性負效應[10]。TEA抑制P13K/Akt信號通路活性，干擾喉癌細胞的正常周期，阻斷DNA合成，直接抑制喉癌細胞增殖和生長，誘導喉癌細胞凋亡[11-12]。為惡性腫瘤的治療探尋了新的途徑與思路。

綜上所述，P13K/Akt信號通路與喉癌細胞的生長和轉移潛能有直接關系[13]。通道阻滯劑TEA下調P13K/Akt信號通路，對人喉癌Hep-2細胞增殖有重要抑制作用，可進一步促進Hep-2細胞凋亡，這一觀察結果具有分子生物學的理論意義[14]。當然，要全面應用到臨床還需要進一步探索。

[1]楊智英，譚超超，楊治平，等．維甲酸對肝癌細胞HtPG2糖基化磷脂酰肌醇特異性磷脂酶D表達及細胞生物學特性的影響[J]．生命科學研究，2012，16(1)：42-47．

[2]宋巖，劉秀萍，白偉良，等．LY294002聯合順鉑阻斷PI3K-Akt通路誘導喉癌Hep-2細胞凋亡研究[J]．實用腫瘤雜志，2013，28(2)：132-134．

[3]李豫江，張偉，趙磊．來氟米特通過PI3K/Akt/mTOR信號通路誘導大鼠系膜細胞凋亡的作用[J]．重慶醫學，2016，45(8)：1022-1025．

[4]魏蕾，江黎珠，于超，等．下調FoxM1表達對人喉癌Hep-2細胞順鉑敏感性的影響[J]．第三軍醫大學學報，2015，37(16)：1603-1608．

[5]Georgakis GV，Younes A．From Rapa Nui to rapamycin:targeting PI3K/Akt/mTOR for cancer therapy[J]．Expert Rev Anticancer Ther，2006，6(1)：131-140．

[6]江紅軻．游泳訓練通過激活P13K-Akt信號通路抑制2型糖尿病引起的心肌細胞凋亡[J]．湖南師范大學自然科學學報，2012，35(3)：71-77．

[7]權悅，馬瑩，周峰，等．多糖偶聯細胞毒性藥物治療惡性腫瘤的研究進展[J]．癌變·畸變·突變，2016，28(1)：77-80．

[8]譚超超，唐建華，盧永娟，等．糖基化磷脂酰肌醇磷脂酶D與動脈粥樣硬化關系的研究[J]．中華老年醫學雜志，2012，31(11)：954-958．

[9]祝冰晶，王宇亮，羅虎，等．CA916798基因通過PI3K/AKT通路參與肺癌順鉑耐藥[J]．第三軍醫大學學報，2013，35(7)：618-621．

[10]張萌，彭利，喬治斌，等．PI3K/Akt信號通路抑制劑對人肝癌HepG2細胞的體外抑制作用及其機制[J]．世界華人消化雜志，2013，21(23)：2250-2257．

[11]余文發，趙玉林，王萍，等．siRNA沉默C-erbB-2基因對人喉癌Hep-2細胞PI3K/Akt信號通路的影響[J]．臨床耳鼻咽喉頭頸外科雜志，2014，28(12)：894-897．

[12]Levine DA，Bogomolniy F，Yee CJ，et al．Frequent mutation of the PIK3CA gene in ovarian and breast cancers[J]．Clin Cancer Res，2005，11(8)：2875-2878．

[13]楊智英，譚超超，楊治平，等．GPI-PLD通過下調PI3K-Akt信號通路活性抑制肝癌細胞的生長[J]．中南大學學報(醫學版)，2014，39(9)：873-878．

[14]Wang M，Vogel I，Kalthoff H．Correlation between metastatic potential and variants from colorectal tumor cell line HT-29[J]．World J Gastroenterol，2003，9(11)：2627-2631．

Effects of down-regulation of PI3K/Akt signaling pathway on growth of laryngeal cancer cells*

WangHuimin，YuWenfa，ZhouHang，LuZhenmin△

(DepartmentofOtorhinolaryngology,FirstAffiliatedHospitalofXinxiangMedical

Objective To investigate the effect of potassium channel blocker tetraethtylamine (TEA) on the proliferation and apoptosis of human laryngeal carcinoma cells (Hep-2) through the PI3K/Akt signaling pathway.Methods TEA acted on HEp-2.The methyl thiazolyl blue (MTT) method was used to determine the Hep-2 cell activity and the proliferation inhibition rate of TEA on Hep-2 was calculated;the Hoechest33258 staining was used to detect cell apoptosis,and the Hep-2 apoptosis rate was detected by flow cytometry (FCM) assay.Results After inoculation by 5,10,20 mmol/L TEA,the Hep-2 cell proliferation inhibition rate reached 12.573%,31.385% and 56.132%,respectively.After 96 h Hep-2 cell action,the cellular apoptosis rates were (41.64±2.67)%,(58.76±4.32)% and (72.65±6.54)% respectively,the inhibition rate and apoptosis rate in the TEA treating group were significantly higher than those in the non-TEA treating group,the differences were statistically significant (P<0.05).Conclusion TEA can inhibit the proliferation and in vivo growth of human laryngeal carcinoma cells and promotes the apoptosis of laryngeal cancer cells.

potassium channel blockers；laryngeal neoplasms；epithelial cells；PI3K/Akt；apoptosis

10.3969/j.issn.1671-8348.2017.21.004

河南省重點科技攻關項目(152102310355)。 作者簡介：王慧敏(1981-)，主治醫師，碩士，主要從事耳鼻咽喉臨床方面的研究。

R739.65；R730.53

A

1671-8348(2017)21-2892-03

2017-02-07

2017-04-12)

△通信作者，E-mail：wmhw741@sina.com。