細胞穿透肽4介導的Cu/Zn SOD對缺氧復氧損傷心肌細胞的影響*

王 宇，李 清，曾文靜，陳靖宜，劉菊英

(十堰市太和醫院/湖北醫藥學院附屬醫院麻醉科，湖北十堰 442000)

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·論 著·

細胞穿透肽4介導的Cu/Zn SOD對缺氧復氧損傷心肌細胞的影響*

王 宇，李 清，曾文靜，陳靖宜，劉菊英△

(十堰市太和醫院/湖北醫藥學院附屬醫院麻醉科，湖北十堰 442000)

目的 評價細胞穿透肽4(又稱為蛋白轉導結構域4，PTD4)介導的銅鋅超氧化物歧化酶(Cu/Zn SOD)對大鼠心肌細胞缺氧復氧損傷(HRI)的影響。方法 用厭氧培養箱[85%氮氣(N2)，10%氫氣(H2)，5% CO2]制作大鼠心肌細胞(H9c2)HRI模型，設置HRI組(HRI的細胞培養液中不加任何處理因素)，HRI+Cu/Zn SOD組(加入10 μmol/L Cu/Zn SOD)、HRI+PTD4-Cu/Zn SOD組(加入10 μmol/L PTD4-Cu/Zn SOD)，另外以正常培養心肌細胞作為正常對照組，孵育30 min后，透射電鏡觀察心肌線粒體超微結構，JC-1試劑盒檢測線粒體膜電位，末端脫氧核苷酸轉移酶(TdT)介導的dUTP缺口末端標記(TUNEL)技術檢測心肌細胞凋亡。結果 PTD4-Cu/Zn SOD組線粒體損傷程度較HRI組有明顯改善。與正常對照組比較，HRI組線粒體膜電位明顯下降，PTD4-Cu/Zn SOD組線粒體膜電位低于正常對照組，但與HRI組比較明顯恢復。HRI+PTD4-Cu/Zn SOD組心肌細胞凋亡指數[(10.20±2.77)%]較HRI組[(28.40±2.41)%]明顯降低，差異有統計學意義(P<0.05)。結論 PTD4介導的Cu/Zn SOD可以減輕大鼠心肌細胞的HRI。

超氧化物歧化酶；細胞穿透肽；缺氧；損傷；心肌

研究發現心肌缺血再灌注損傷的發病機制反映了復合通路的匯集，包括氧自由基、離子通道、炎性反應和內皮功能障礙等，其中再灌注后初始幾分鐘內氧自由基大量產生及鈣超載最為顯著[1]。銅鋅超氧化物歧化酶(Gu/Zn superoxide dismutase，Gu/Zn SOD)是一種特異性內源性自由基清除劑，在清除機體氧自由基(ROS)的抗氧化反應過程中最早發揮作用[2]。但是，由于Gu/Zn SOD在哺乳動物細胞膜上沒有專一受體或通道，外源性的Gu/Zn SOD很難進入細胞和組織內發揮生物學作用。目前，可采用細胞穿透肽4(又稱為蛋白轉導結構域4，PTD4)作為載體，介導外源性Gu/Zn SOD進入細胞發揮作用。前期研究表明，PTD4可將Gu/Zn SOD導入大鼠心肌細胞，且具有生物活性。本研究擬評價PTD4介導的Cu/Zn SOD(PTD4-Cu/Zn SOD)對大鼠心肌細胞缺氧復氧損傷(HRI)的影響。

1 材料與方法

1.1 細胞來源 大鼠心肌細胞H9c2，購自美國ATCC公司。

1.2 方法

1.2.1 PTD4-Cu/Zn SOD的制備 參照文獻[3]制備融合蛋白PTD4-Cu/Zn SOD。具體方法如下：合成細胞穿透肽PTD4基因片段，將其與具有相同酶切位點的載體質粒PET16b連接，得到重組質粒PET16b-PTD4。提取胚胎肝臟組織的總RNA，以其為模板用于Cu/Zn SOD全長CDs的反轉錄和擴增，將獲得的Cu/Zn SOD全長CDs片段與線性化的載體質粒PET16b-PTD4進行重組，獲得含有Cu/Zn SOD基因片段的重組質粒pET16b-PTD4-Cu/Zn SOD(CDs)。將獲得的pET16b-PTD4-Cu/Zn SOD(CDs)原核表達載體導入感受態大腸桿菌表達菌株BL21(DE3)中，進行擴增培養，收集菌體，將其裂解離心，鎳離子(Ni2+)親和層析柱層析，收集目的蛋白，定量后分別儲存于-70 ℃冰箱內備用。

1.2.2 HRI模型的構建 6孔板中的細胞在37 ℃ CO2培養箱中培養24 h后換液，細胞長滿至80%后，用磷酸鹽緩沖液(PBS)沖洗，再加入不含血清的低糖DMEM，置入含85%氮氣(N2)、10%氫氣(H2)、5% CO2的37 ℃飽和濕度厭氧培養箱，培養4 h后取出，完成缺氧。缺氧后，加入新鮮含15%胎牛血清的DMEM培養基，置入CO2培養箱中繼續培養2 h，完成復氧。

1.2.3 細胞分組 將培養的細胞分為4組，正常對照組：正常培養的心肌細胞；HRI組：在HRI的細胞培養液中不加任何處理因素；HRI+PTD4-Gu/Zn SOD組：在HRI的細胞培養液中加入10 μmol/L PTD4-Gu/Zn SOD融合蛋白；HRI+Gu/Zn SOD組：在HRI的細胞培養液中加入10 μmol/L Gu/Zn SOD融合蛋白，然后共同孵育30 min。

1.2.4 心肌細胞線粒體模電位檢測 JC-1是近年來發現的一種具有高度特異性，能快速靈敏地檢測細胞線粒體膜電位的線粒體熒光探針[4]。在線粒體膜電位較高時，JC-1聚集在線粒體基質中，形成聚合物，產生紅色熒光；在線粒體膜電位較低時，JC-1不能聚集在線粒體基質中，此時JC-1為單體，產生綠色熒光，這樣即可通過熒光顏色的轉變來檢測線粒體膜電位的變化。吸出每孔的培養液，PBS洗滌細胞1次，再加入1 mL培養液。再加入1 mL JC-1染色工液，充分混勻，37 ℃孵育20 min，吸去上清液，用JC-1染色緩沖液洗滌2次(冰浴)。熒光顯微鏡下觀察。

1.2.5 細胞凋亡檢測 采用末端脫氧核苷酸轉移酶(TdT)介導的dUTP缺口末端標記(TUNEL)技術檢測細胞凋亡，4%多聚甲醛固定細胞30～60 min，隨后用PBS洗滌3次，每次5 min。加入含0.2% TritonX-100的PBS，冰浴5 min。PBS洗滌2次，每次5 min。滴加100 μL平衡緩沖液(Equilibration Buffer)于樣品區域上，室溫平衡5～10 min。滴加100 μL的TdT反應液于樣品區域上，于37 ℃濕盒中孵育60 min。樣品放入20×SSC溶液的染色缸中終止反應，加100 μL鏈霉親和素-辣根過氧化物酶(Streptavidin-HRP)室溫孵育30 min。室溫顯色30 s至5 min，最后用蒸餾水沖洗終止顯色。蘇木精復染30 s至1 min，脫水后封片。顯微鏡下觀察，凋亡的細胞顯色為棕褐色。每份標本選取400倍視野5個，每個視野數100個心肌細胞，計數各視野陽性凋亡細胞數，各視野凋亡指數(AI)=各視野凋亡細胞數/100，每張片子的AI等于各視野AI的平均值(單個周圍無明顯炎性反應)。

1.2.6 心肌細胞及線粒體超微結構觀察 使用細胞刮刮下細胞，4 ℃ PBS離心漂洗后，貼壁加入500 μL 4 ℃ 2.5%戊二醛，于4 ℃冰箱靜置3 d，透射電鏡下觀察心肌細胞及線粒體超微結構改變。

2 結 果

2.1 各組心肌細胞超微結構觀察 正常對照組：細胞結構形態正常，線粒體無腫脹，膜結構完整，嵴緊密整齊排列，細胞核染色質均勻。HRI組：細胞結構不清晰，線粒體明顯腫脹，膜結構模糊不清，部分發生斷裂，嵴疏松溶解排列紊亂，有明顯的空泡形成，細胞核染色質減少。HRI+Cu/Zn SOD組：線粒體腫脹，膜結構模糊不清，嵴排列紊亂，部分斷裂溶解，部分空泡形成，出現細胞核染色質邊集。HRI+PTD4-Cu/Zn SOD組：細胞形態基本正常，線粒體輕度腫脹，膜基本完整，線粒體嵴密集，部分溶解，沒有明顯空泡形成，胞核染色質均勻，邊集少見。HRI+PTD4-Cu/Zn SOD組線粒體損傷程度明顯低于HRI組，HRI+Cu/Zn SOD組線粒體損傷程度與HRI組相比無明顯差別，見圖1。

2.2 心肌細胞線粒體膜電位檢測 正常心肌細胞呈現紅色熒光，沒有綠色熒光(沒有線粒體膜電位下降)，正常對照中細胞均呈現綠色熒光(線粒體膜電位下降明顯)。與HRI組、HRI+Cu/Zn SOD組相比，HRI+PTD4-Cu/Zn SOD組紅色熒光明顯增強。HRI+Cu/Zn SOD組與HRI組相比較，紅色熒光增強不明顯，見圖2。

2.3 各組心肌細胞凋亡情況 TUNEL染色結果顯示：與正常對照組相比，HRI組心肌細胞可見大量棕褐色的凋亡細胞。HRI+Cu/Zn SOD組與HRI組相比，心肌凋亡細胞沒有明顯減少。HRI+PTD4-Cu/Zn SOD組棕褐色凋亡細胞較HRI組明顯減少，見圖3。與正常對照組[(2.40±1.14)%]比較，HRI組[(28.40±2.41)%]、HRI+Cu/Zn SOD組[(25.80±2.17)%]、HRI+PTD4-Cu/Zn SOD組[(10.20±2.77)%]的AI均明顯升高，差異均有統計學意義(P<0.01)；HRI+Cu/Zn SOD組與HRI組AI比較，差異無統計學意義(P>0.05)；HRI+PTD4-Cu/Zn SOD組與HRI組、HRI+Cu/Zn SOD組AI比較，差異均有統計學意義(P<0.01)。

A：正常對照組；B：HRI組；C：HRI+Cu/Zn SOD組；D：HRI+PTD4-Cu/Zn SOD

圖1 各組心肌細胞線粒體超微結構的觀察(×4 000)

A：正常心肌細胞；B：正常對照組；C:HRI組；D：HRI+Cu/Zn SOD組；E：HRI+PTD4-Cu/Zn SOD

圖2 各組心肌細胞線粒體膜電位的變化

A：正常對照組；B：HRI組；C：HRI+Cu/Zn SOD組；D：HRI+PTD4-Cu/Zn SOD

圖3 TUNEL法檢測各組心肌細胞中細胞凋亡情況(×100)

3 討 論

50年前已有學者描述心肌缺血再灌注損傷現象，通過不斷深入的探索，對其潛在機制的理解也顯著增加，主要包括ROS爆發式生成、鈣離子(Ca2+)超載、內皮細胞功能障礙、炎性反應等，最終導致以心肌細胞凋亡為主要特征的不可逆損傷[5]。心肌缺血再灌注后最初數分鐘內ROS的爆發式生成被認為是心肌損傷的始動因素和重要機制。本研究利用PTD4攜帶缺乏內源性受體的自由基清除劑Cu/Zn SOD，在再灌注損傷早期進入心肌細胞內，以期在ROS生成早期就大量清除，從而改善心肌細胞的再灌注損傷。

線粒體作為能量代謝的主要場所，與再灌注損傷各個環節密切相關，成為心肌細胞凋亡等損傷環節的重要保護靶點[6]。線粒體的完整性對心肌細胞的存活至關重要，心肌HRI與線粒體形態變化相關，HRI過程中線粒體趨向于分裂或片段化[6]。本研究透射電鏡觀察發現，HRI組細胞結構不清晰，線粒體明顯腫脹，膜結構模糊不清，部分發生斷裂，嵴疏松溶解排列紊亂，有明顯的空泡形成，細胞核染色質減少。而PTD4-Cu/Zn SOD融合蛋白組細胞形態基本正常，線粒體輕度腫脹，膜基本完整，線粒體嵴密集，部分溶解，沒有明顯空泡形成，細胞核染色質均勻，邊集少見。直觀上可以觀察到PTD4-Cu/Zn SOD融合蛋白，減輕了心肌細胞線粒體的HRI。

當線粒體受損時，線粒體膜通透性增加，線粒體膜電位下降。因此，將線粒體膜電位改變作為判斷線粒體膜通透性改變的指標，線粒體膜電位下降則標志著線粒體受損及細胞凋亡的開始[7]。ROS可導致線粒體跨膜電位崩解，呼吸鏈解耦聯，線粒體基質滲透壓升高，內膜腫脹，最終可引起細胞的凋亡。在本實驗中觀察到，心肌細胞HRI引起線粒體膜電位的顯著下降，而PTD4-Cu/Zn SOD融合蛋白的干預顯著減輕線粒體膜電位的下降。在細胞凋亡的檢測中，這一趨勢得到進一步證實，PTD4-Cu/Zn SOD融合蛋白處理明顯減少了因HRI導致的心肌細胞凋亡數目。證實PTD4-Cu/Zn SOD融合蛋白能夠有效地抑制線粒體膜電位的降低，從而減少HRI引起的心肌細胞凋亡。

本研究依賴于生物信息學蛋白結構和跨膜蛋白結構的原理，設計合成具有高效穿膜活性的PTD穿透肽結構和融合表達的Cu/Zn SOD[8]，且經過實驗顯示出良好的穿膜特性。研究結果表明，PTD4-Cu/Zn SOD融合蛋白轉導后進入HRI大鼠H9C2心肌細胞內，減輕了線粒體的形態和結構的損傷，抑制了線粒體膜電位的降低，最終減少了心肌細胞的凋亡。

綜上所述，細胞穿透肽PTD4介導的Cu/Zn SOD可以減輕大鼠心肌細胞HRI。

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Effects of Cu/Zn SOD mediated by cell penetrating peptide 4 on hypoxia/reoxygenation injury in myocardial cells*

WangYu,LiQing,ZengWenjing,ChenJingyi,LiuJuying△

(DepartmentofAnesthesiology,TaiheHospital/AffiliatedHospitalofHubeiUniversityofMedicine,Shiyan,Hubei442000,China)

Objective To evaluate the effect of cell-penetrating peptide (protein transduction domain 4,PTD4) mediated copper-zinc superoxide dismutase (Cu/Zn SOD) on hypoxia/reoxygenation injury (HRI) in rat myocardial cells.Methods Rat myocardial cell H9C2 HRI model was prepared by using the anaerobic incubator (85% N2,10% H2,5% CO2).The HRI group (without adding any treating factor in HRI cell culture fluid),HRI+Cu/Zn SOD group (adding 10 μmol/L Cu/Zn SOD) and HRI+PTD4-Cu/Zn SOD group (10 μmol/L PTD4-Cu/Zn SOD) were set up.In addition,normally cultured myocardial cells served as the normal control group.After incubating for 30 min,the ultra microstructure of mitochondria was observed under transmission electron microscope.The mitochondrial membrane potential was detected by JC-1 kit.The myocardial cell apoptosis was detected by TdT mediated dUTP nick end labeling TUNEL technique.Results The mitochondria injury degree after 30 min incubation in the PTD4-Cu/Zn SOD group was significantly improved compared with the HRI group.Compared with the normal control group,the mitochondrial membrane potential in the HRI group was significantly decreased,while the mitochondrial membrane potential in the PTD4-Cu/Zn SOD group was lower than that in the normal control group,but compared with the HRI group,which was obviously recovered.The cardiomyocyte apoptosis in the HRI+PTD4-Cu/Zn SOD group was (10.20±2.77)%,which was significantly decreased compared with (28.40±2.41)% in the HRI group,the difference was statistically significant (P<0.05).Conclusion PTD4 mediated Cu/Zn SOD can attenuate HRI in rat myocardial cells.

superoxide dismutase;cell penetrating peptide;anoxia;injuries;myocardium

10.3969/j.issn.1671-8348.2017.21.001

國家自然科學基金資助項目(81171783)。 作者簡介：王宇(1982-)，主治醫師，碩士，主要從事圍術期器官保護方面的研究。

R363

A

1671-8348(2017)21-2881-03

2017-02-03

2017-04-08)

△通信作者，E-mail：liu6119@163.com。