HIF-1α介導上調BNIP3在蛛網膜下腔出血后早期皮層神經元凋亡中的作用機制

胡強 俞文華 陳高 杜權

HIF-1α介導上調BNIP3在蛛網膜下腔出血后早期皮層神經元凋亡中的作用機制

胡強 俞文華 陳高 杜權

目的 探討缺氧誘導因子-1α（HIF-1α）、BNIP3在蛛網膜下腔出血（SAH）后早期皮層神經元凋亡中的作用機制。方法 采用頸內動脈穿刺法建立SAH大鼠模型，設SAH組、2-甲氧雌二醇（2ME2）組和假手術（sham）組，每組10只。造模后24h對SAH大鼠神經功能進行評價；取大鼠腦組織，采用TUNEL法檢測凋亡指數，免疫熒光染色檢測HIF-1α的組織細胞定位，Western blot檢測HIF-1α、BNIP3蛋白表達水平。 結果 與sham組比較，造模后24h SAH組大鼠腦組織中HIF-1α、BNIP3蛋白表達水平均明顯升高（均P＜0.05），凋亡指數明顯增高（P＜0.05），神經功能評分明顯降低（P＜0.05）。與SAH組比較，2ME2組大鼠腦組織中HIF-1α、BNIP3蛋白表達水平均明顯下降（均P＜0.05），凋亡指數明顯下降（P＜0.05），神經功能評分明顯升高（P＜0.05）。HIF-1α主要定位表達于神經元。 結論 HIF-1α介導上調BNIP3并參與了SAH后早期皮層神經元凋亡過程。

蛛網膜下腔出血 缺氧誘導因子-1α 凋亡 BNIP3

蛛網膜下腔出血（SAH）具有較高的致殘率、病死率，約85%由顱內動脈瘤破裂所致[1]。目前治療手段（手術夾閉、介入栓塞）以及神經影像技術等不斷進步，然而SAH患者預后改善并不顯著。近年來研究表明早期腦損傷（EBI）與SAH患者高風險致殘、病死等密切相關，及時對EBI進行有效干預可能改善患者預后[2-4]。EBI涉及一系列病理、生理變化，具體發病機制尚不清楚，現有研究指出細胞凋亡在SAH后EBI中發揮重要作用[5-6]。相關文獻報道缺氧誘導因子-1α（HIF-1α）在SAH后腦組織表達明顯增多[7-8]，但它在SAH后EBI中的具體機制尚未清楚。BNIP3是HIF-1α的重要靶基因之一，它是Bcl-2家族蛋白，參與細胞凋亡過程。本研究通過建立SAH大鼠模型，并予HIF-1α抑制劑干預，檢測大鼠腦組織HIF-1α和BNIP3表達水平、細胞凋亡情況、神經功能評分及HIF-1α的組織細胞定位，以初步探討HIF-1α、BNIP3在SAH后早期皮層神經元凋亡中的作用機制。

1 材料和方法

1.1 實驗動物及主要試劑 健康雄性SD大鼠30只，月齡2～3個月，體重280～320g，均購于上海斯萊克實驗動物中心；按照隨機數字表法分為SAH組、2-甲氧雌二醇（2ME2）組和假手術（sham）組，每組10只。2ME2、二甲亞砜、多聚甲醛均購自美國Sigma公司，TUNEL試劑盒和4′，6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI）均購自美國Roche公司，兔抗HIF-1α和小鼠抗BNIP3一抗均購自Abcom公司，小鼠抗膠質纖維酸性蛋白（GFAP）、小鼠抗神經元特異性核蛋白（NeuN）一抗均購自美國Millipore公司，TRITC標記羊抗兔和FITIC標記羊抗小鼠二抗均購自北京中杉金橋公司，熒光顯微鏡購自日本Olympus公司。

1.2 SAH造模及評價 本研究采用頸內動脈穿刺法制作SAH模型。大鼠經麻醉后取頸部正中入路，充分顯暴右側頸外動脈（ECA）、頸內動脈（ICA）及頸總動脈（CCA）。結扎并切斷ECA遠端，取單股尼龍線從ECA輕輕插入ICA顱內段，刺破血管壁，造成SAH，拔出尼龍線，用絲線結扎頸外動脈殘端，嚴密縫合頸部切口。sham組大鼠除了不進行穿刺血管壁外，其余步驟同上。2ME2組大鼠在SAH造模成功后1h按5mg/kg腹腔注射1%二甲亞砜溶解的2ME2試劑；SAH組和sham組大鼠均在造模后1h腹腔注射等體積1%二甲亞砜。造模后24h取腦組織標本，此時可見Willis動脈環周圍存在血凝塊。SAH出血評分參照Sugawara等[9]改良的方法進行評價，出血評分≤8分的大鼠予以剔除，用備用大鼠替代補充。若術中或術后24h內出現大鼠死亡情況，及時補充以確保各組10只樣本。造模后24h參照Carcia等[10]制訂經改良的18分評價法對各組大鼠神經功能進行評價。

1.3 免疫組化染色

1.3.1 組織學標本采集 造模后24h，將大鼠（每組5只）深度麻醉，經左心室灌注后取出腦組織，放入4%多聚甲醛溶液固定24h，再經30%蔗糖溶液脫水直至沉底。用恒冷箱冰凍切片機取大腦冠狀位切薄片貼敷于載玻片，置于-80°C超低溫冰箱中保存。

1.3.2 TUNEL染色 嚴格按照試劑盒說明書操作。切片經復溫、封閉及透膜，滴加50μl TUNEL反應液，避光孵育60min，漂洗后DAPI染色，漂洗后封片，觀察拍照。每張切片在右側額底皮層區隨機取3個視野（×400），觀察陽性細胞并計算凋亡指數。

1.3.3 熒光雙標染色 切片經復溫及封閉，滴加一抗稀釋液（兔抗HIF-1α和小鼠抗NeuN混合物，1∶200）；4°C濕盒孵育過夜，漂洗，滴加熒光二抗稀釋液（TRITC標記羊抗兔和FITIC標記羊抗小鼠混合物，1∶150）；37°C避光孵育90min，漂洗后DAPI染色，清洗后封片，觀察拍照。HIF-1α與GFAP熒光雙標染色用小鼠抗GFAP單抗替代小鼠抗NeuN單抗，其余操作步驟同上。HIF-1α與TUNEL熒光雙標染色先行TUNEL染色，再行HIF-1α染色。

1.4 Western blot檢測蛋白表達 造模后24h，將大鼠（每組5只）深度麻醉，經灌注后斷頭取腦；從右側額底皮層取少量組織，稱重、裂解、勻漿、離心（15 000g，15min，4℃）；將等量的蛋白樣品（60μg）加入上樣緩沖液，變性（95℃，10min），將樣品加入SDS-PAGE垂直電泳，轉移至PVDF膜，封閉（30 min），滴加一抗（HIF-1α，1∶1 000；BNIP3，1∶1 000；β-actin，1∶2 000） 孵育過夜（4℃）；洗膜后滴加二抗，室溫下孵育60min，經洗膜、曝光、顯影并作定量分析。

1.5 統計學處理 應用SPASS 19.0統計軟件。計量資料用表示，多組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用SNK-q檢驗。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 3組大鼠SAH出血及神經功能評分比較 SAH組、2ME2組SAH出血評分為（14.00±1.70）、（13.30±1.89）分，兩組比較差異無統計學意義（P＞0.05），見圖1a；這表明兩組大鼠SAH損傷程度基本一致。SAH組大鼠造模后24h神經功能評分為（12.40±1.34）分，明顯低于sham組的（17.10±0.74）分（P＜0.05）；2ME2組大鼠神經功能評分為（13.90±1.10）分，較SAH組明顯升高（P＜0.05），見圖1b。sham組大鼠基底動脈環周圍未見出血；SAH組、2ME2組大鼠基底動脈環周圍可見血凝塊，表明模型建立成功，見圖2。

2.2 3組大鼠凋亡指數比較 sham組同側前額底皮層幾乎未觀察到TUNEL陽性細胞，其凋亡指數為（0.74± 0.61）%；SAH組同側前額底皮層出現大量的TUNEL陽性細胞，呈散在性分布，其凋亡指數為（30.78±6.63）%，較sham組明顯增多（P＜0.05）；2ME2組同側前額底皮層TUNEL陽性細胞數明顯減少，其凋亡指數為（16.79± 5.92）%，較SAH組明顯減少（P＜0.05）。

圖1 3組大鼠SAH出血及神經功能評分

圖2 3組大鼠基底動脈環周圍所見（a：sham組大鼠基底動脈環周圍未見出血；b：SAH組和2ME2組大鼠基底動脈環周圍可見血凝塊；c：SAH出血評分≤8分的標本，予以剔除）

2.3 3組大鼠熒光雙標染色結果 SAH組大鼠造模后24h在出血同側前額皮層可見大量HIF-1α陽性細胞；部分細胞呈現HIF-1α/NeuN雙重陽性，而未見HIF-1α/ GFAP雙重陽性細胞，可見HIF-1α主要定位表達于神經元，見圖3a-f；部分細胞呈現HIF-1α/TUNEL雙重陽性，提示部分細胞HIF-1α蛋白和凋亡共表達，見圖3g-i。

圖3 HIF-1α分別與NeuN、GFAP及TUNEL熒光雙標染色結果

2.4 3組大鼠皮層HIF-1α、BINP3蛋白表達比較 sham組同側大腦額底皮層HIF-1α、BINP3蛋白表達水平均很低，分別為1.00±0.16、1.00±0.29；與sham組比較，SAH組造模后24h同側大腦額底皮層HIF-1α、BINP3蛋白表達水平均明顯升高，分別為2.49±0.36、1.85±0.29（均P＜0.05）；與SAH組比較，2ME2組大鼠同側大腦額底皮層HIF-1α、BINP3蛋白表達水平均明顯下降，分別為1.66±0.29、1.40±0.18（均P＜0.05），見圖4。

圖4 3組大鼠皮層HIF-1α、BINP3蛋白表達的電泳圖

3 討論

通常在缺氧條件下，HIF-1α的降解會受抑制而轉錄活性增加，在細胞質中積累并進入細胞核與HIF-1β結合成異源二聚體HIF-1，通過調節下游基因適應缺氧環境。動物實驗表明，HIF-1α在腦缺氧、腦出血時大量表達[11]。動物缺血缺氧腦損傷模型研究提示HIF-1α的作用仍須進一步探討[12-13]。低氧預處理誘導HIF-1α在動物腦組織中表達具有神經保護作用[14]，而在缺血缺氧腦損傷研究提示上調表達的HIF-1α可通過其靶基因介導神經元凋亡[11]。雖然已有研究報道SAH后HIF-1α在腦組織中表達升高，但關于其在SAH后EBI中的作用仍有爭議。有學者發現大鼠SAH后去鐵胺誘導的HIF-1α表達水平上升，可減輕基底動脈血管痙攣，并改善腦干血流量[15]。Yan等[16]研究表明SAH后基底動脈血管中穩定表達的HIF-1α在腦血管痙攣過程中發揮著重要作用，應用HIF-1α抑制劑干預HIF-1α的表達，可減輕SAH后腦血管痙攣。筆者前期研究結果表明，SAH后早期HIF-1α與細胞凋亡之間存在相關性[17]。早期凋亡過程中線粒體功能被干擾，在介導細胞凋亡時發揮著重要作用。BNIP3通過影響線粒體功能降低Bcl-2蛋白對凋亡的抑制作用，從而發揮促凋亡作用。大鼠缺氧腦損傷模型中腦組織HIF-1α介導BNIP3上調，可誘導細胞凋亡。

為探討HIF-1α、BINP3在SAH后早期皮層神經元凋亡的作用機制，筆者采用頸內動脈穿刺法建立SAH模型進行研究。該模型造成瞬時顱內壓升高、腦灌注壓急劇下降及神經功能障礙，比較真實地模擬了臨床上動脈瘤破裂的病理、生理過程，是國內外研究SAH后EBI常用模型之一[18]。此外，本研究參照Sugawara等[9]改良的評分法對SAH嚴重程度進行評價，剔除SAH出血評分≤8分的標本。該模型手術同側前額底為血流沖擊最大、血凝塊最明顯的區域，多數學者選取額底皮層作為研究SAH后EBI的部位。本研究發現HIF-1α主要定位表達于神經元，同時HIF-1α與部分凋亡細胞共同表達；這表明SAH后大量表達的HIF-1α與早期皮層神經元凋亡存在相關性。TUNEL染色結果發現SAH組造模后24h額底皮層大量細胞凋亡，呈散在性分布；2ME2組（HIF-1α抑制劑干預后）細胞凋亡明顯減少；Western blot檢測結果顯示，造模后24h SAH組大鼠大腦額底皮層HIF-1α、BNIP3大量表達，而2ME2可抑制這一效果。大鼠神經功能評價結果顯示，2ME2能明顯改善大鼠神經功能。

綜上所述，SAH后大量表達的HIF-1α介導上調BNIP3表達并參與了早期皮層神經元凋亡過程，進一步明確了HIF-1α、BNIP3在SAH后EBI中的作用，為臨床治療EBI提供了新思路。但是HIF-1α下游參與BNIP3調控的具體分子機制仍需進一步研究。

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HIF-1α mediated up-regulation of BNIP3 involving in early cortical apoptosis after subarachnoid hemorrhage

HU Qiang,YU Wenhua,CHEN Gao,et al.Department of Neurosurgery,Hangzhou First People's Hospital,Hangzhou 310006,China

Objective To investigate the role of hypoxia inducible factor-1α(HIF-1α)and BCL2/adenovirus E1B 19 kDa protein-interacting protein 3 (BNIP3)in early cortical apoptosis after subarachnoid hemorrhage (SAH). Methods Thirty Sprague-Dawley rats were randomly divided into sham,2-methoxyestradiol(2ME2),and SAH groups with 10 animals in each. The SAH model was induced by endovascular perforation on internal carotid in rats of 2ME2 and SAH groups.The neurological scores were recorded 24h after SAH induced.The expression of HIF-1α and BNIP3 was detected by Western blotting. TdT-mediated dUTP-biotin nick end-labeling(TUNEL)technique was adopted to detect apoptotic cell.HIF-1α-positive cells were observed by double fluorescence labeling. Results Compared to sham group,expression of HIF-1α and BNIP3 was increased,marked cell apoptosis and neurologic function decline were observed in brain tissue of SAH group 24 h after model induced (P＜0.05).Compared to SAH group,the expression of HIF-1α and BNIP3 was suppressed,cell apoptosis was diminished and neurologic function improved in 2ME2 group(P＜0.05).Double fluorescence labeling showed that HIF-1α was mainly located in neurons. Conclusion These data indicated that HIF-1α-mediated up-regulation of BNIP3 in involved in early cortical apoptosis after subarachnoid hemorrhage.

Subarachnoid hemorrhage Hypoxia-inducible factor-1α Apoptosis BNIP3

2017-02-15）

（本文編輯：陳丹）

10.12056/j.issn.1006-2785.2017.39.14.2017-787

國家自然科學基金（81171094）

310006 杭州市第一人民醫院（南京醫科大學附屬杭州醫院）神經外科（胡強、俞文華、杜權）；浙江大學醫學院附屬第二醫院神經外科（陳高）

俞文華，E-mail：ywh669@126.com