利用退火反應(yīng)產(chǎn)生粘性末端的基因克隆新方法

趙婷婷 曾靜靜 王啟軍 褚茂平

利用退火反應(yīng)產(chǎn)生粘性末端的基因克隆新方法

趙婷婷 曾靜靜 王啟軍 褚茂平

目的 通過引物設(shè)計和退火反應(yīng)產(chǎn)生內(nèi)切酶的粘性末端，旨在開發(fā)一種高效、簡單、可靠的分子克隆方法。方法 選定限制性內(nèi)切酶（平末端或者粘性末端）設(shè)計3條或4條引物，同時進行兩次獨立的聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR），隨后把兩次PCR產(chǎn)物回收后混在一起經(jīng)過解鏈退火，再將其與雙酶切的載體質(zhì)粒進行連接反應(yīng)，最后轉(zhuǎn)化即可得到目的克隆。 結(jié)果 利用此方法成功一次性將若干靶基因（P90rsk、Nprl2、Mios、Ragc、S6k、Pkca）構(gòu)建在經(jīng)EcoRV和NotI雙酶切后的pcDNA3.1(+)載體上，經(jīng)酶切及測序驗證。 結(jié)論 該方法無需考慮靶基因內(nèi)部是否存在酶切位點，可省去PCR產(chǎn)物酶切及之后的純化回收過程，可快速并準(zhǔn)確地克隆目標(biāo)基因。

分子克隆 聚合酶鏈反應(yīng) 退火 限制性酶切位點 粘性末端

分子克隆是分子生物學(xué)實驗的常用手段之一。傳統(tǒng)的分子克隆利用限制性內(nèi)切酶切割產(chǎn)生粘性末端以進行目標(biāo)分子和載體的特異性連接[1]。然而，這種方法具有很大的局限性：當(dāng)目標(biāo)片段含有質(zhì)粒多克隆位點上所有的限制性內(nèi)切酶時無論選哪一種限制性內(nèi)切酶都將導(dǎo)致目標(biāo)DNA片段的切割[2]；在進行多個基因克隆時，因各基因序列不同引起的限制性內(nèi)切酶的選擇不一，使得多個基因的克隆變成一個浩大的工程[2]。為了解決傳統(tǒng)克隆方法的局限性，此前研究者作出了一定的嘗試[3-14]，如利用同源重組反應(yīng)[3-4]和TA克隆方法，兩者或增加對重組酶的依賴性或極易出現(xiàn)非特異性突變及二次克隆而不被普遍使用[15-16]。……