青蒿琥酯誘導胃癌BGC-823細胞死亡的實驗研究

王維明 周香 鄭志強

●論 著

青蒿琥酯誘導胃癌BGC-823細胞死亡的實驗研究

王維明 周香 鄭志強

目的 觀察青蒿琥酯（ART）對胃癌細胞株BGC-823的裸鼠移植瘤生長的影響，并探討其可能的作用機制。方法將胃癌BGC-823細胞注射至裸鼠右側背部近腋下部位皮下，建立荷瘤裸鼠模型并隨機分為空白對照組（0mg/kg ART組）、60mg/kg ART組、120mg/kg ART組、240mg/kg ART組，每組5只。各組裸鼠每天腹腔注射ART1次（空白對照組注射0.9%氯化鈉溶液），連續15d，觀察裸鼠移植瘤生長情況，并采用RT-PCR、免疫組化及Western blot法測定血管內皮生長因子（VEGF）及鈣中性蛋白酶2（Calpain2）表達情況。結果 4組裸鼠移植瘤體積比較有統計學差異（P＜0.05），兩兩比較亦有統計學差異（均P＜0.05），與空白對照組比較，60mg/kg ART組、120mg/kg ART組、240mg/kg ART組裸鼠移植瘤體積均明顯縮小，ART表現出劑量依賴性的抑瘤作用。4組胃癌BGC-823細胞VEGF、Calpain2 mRNA與蛋白表達水平比較均有統計學差異（均P＜0.05），兩兩比較亦有統計學差異（均P＜0.05），與空白對照組比較，60 mg/kg ART組、120 mg/kg ART組、240 mg/kg ART組細胞VEGF mRNA與蛋白相對表達水平均下降，Calpain2 mRNA與蛋白相對表達水平均升高，且VEGF相對表達水平隨ART濃度升高而降低，而Calpain2相對表達水平隨ART濃度升高而升高。結論 ART在胃癌移植瘤模型體內起劑量依賴性的抑瘤作用，該作用機制可能與下調VEGF的表達、上調Calpain2的表達有關。

青蒿琥酯 胃癌 裸鼠模型

青蒿琥酯（ART）是青蒿素衍生物，即二氫青蒿素-10-α-丁二酸單酯，分子式C19H28O8，有較好的水溶性，是具有過氧化橋的倍半萜類化合物。研究表明，ART具有抗腫瘤作用，且具有低毒性、不存在交叉耐藥等優勢[1-2]。細胞脹亡是指以細胞腫脹為突出特征的細胞死亡，其形態表現與凋亡不同[3]。筆者團隊前期研究發現，ART體外作用于胃癌BGC-823細胞后，細胞出現腫脹、溶解性死亡，呈典型的細胞脹亡特征[4-5]。基于此，本研究進一步通過體內實驗探討ART誘導胃癌細胞死亡的作用機制，以期為臨床胃癌的治療提供參考，現報道如下。

1 材料和方法

1.1 材料 人胃腺癌細胞株BGC-823由上海生命科學研究所提供；20只無胸腺的BALB/c裸鼠購自上海斯萊克實驗動物有限責任公司。ART注射液（廣西桂林南藥制藥廠，國藥準字H10930195，批號LA100703）；PrimeScript RT reagent Kit、SYBR Premix Ex TaqTM購自日本Takara公司；兔抗人血管內皮生長因子（VEGF）及鈣中性蛋白酶2（Calpain2）多克隆抗體購自英國abcam公司；即用型免疫組化二抗試劑盒及DAB、蘇木素復染液購自北京中杉金橋生物技術有限公司。

1.2 方法

1.2.1 癌細胞的培養及實驗模型的建立 胃癌BGC-823細胞培養于完全RPMI-1640培養液（含10%FBS、100IU/ml青霉素、100IU/ml鏈霉素）中，置于37℃、5%二氧化碳的培養箱中培養。用胰蛋白酶消化對數生長期BGC-823細胞，用含10%FBS的1640培養基終止消化。離心后將細胞用不含血清的1640培養基洗滌1次，再次離心將細胞混勻于不含血清的1640培養基中。將BGC-823細胞懸浮，用一次性注射器注射至裸鼠右側背部近腋下部位皮下，每只注射約1×107個細胞。1周后，所有裸鼠的移植瘤體積約200mm3，成瘤率100%。實驗過程遵循浙江省有關實驗動物保護與使用的準則。

1.2.2 具體給藥情況及觀察指標 根據移植瘤體積大小排序，將荷瘤裸鼠按隨機數字表法分為4組：空白對照組（0mg/kg ART組）、60mg/kg ART組、120mg/kg ART組、240mg/kg ART組，每組5只。分組后第2天開始給藥，各組每天腹腔注射ART 1次（空白對照組注射0.9%氯化鈉溶液）。每次均在注射藥物前測量體重，并根據體重進行給藥，連續給藥15d。移植瘤體積=（荷瘤裸鼠的長徑×短徑2）/2。每隔3d測量移植瘤體積大小1次，觀察裸鼠活躍性，記錄結果并計算各組抑瘤率 [抑瘤率＝（空白對照組移植瘤平均體積－實驗組組移植瘤平均體積）/空白對照組移植瘤平均體積×100%]。

1.2.3 RT-PCR檢測VEGF、Calpain2 mRNA表達 分組同上，Trizol法提取總RNA。取500 ng的RNA，按試劑盒DRR037A說明書逆轉錄合成cDNA。引物探針由上海基康生物技術有限公司設計并合成。VEGF上游引物5′-AGGAGGGCAGAATCATCACG-3′，下游引物5′-CA－TTTGTTGTGCTGTAGGAAGCT-3′。Calpain2上游引物5′-GAAGGGTGGAGCCAGGTAGA-3′；下游引物：5′-GGGAAAGCCGCTGTTGTT-3′。內參基因ACTB上游引物5′-CGTGGACATCCGCAAAGAC-3′，下游引物5′-AAGAAAGGGTGTAACGCAACTAAG-3′。熒光定量PCR反應體系及條件參照SYBR Premix Ex TaqTM說明書。數據采用LightCycler 480軟件分析，以各組VEGF、Calpain2 mRNA與ACTB的相對表達水平作為衡量基因半定量表達的結果。

1.2.4 免疫組化法檢測VEGF、Calpain2蛋白定性表達 取空白對照組及120 mg/kg ART組標本置于4%多聚甲醛中固定，包埋切片。石蠟切片脫蠟去水；3%雙氧水室溫孵育5～10min以滅活內源性過氧化物酶；加0.01 mol/L檸檬酸鹽緩沖液（pH 6.0），于微波爐內修復10 min；滴加5%BSA封閉液，室溫孵育20 min，滴加一抗工作液（1∶100稀釋），4℃過夜；PBS沖洗，5 min×3次，滴加適量生物素標記二抗工作液，37℃孵育30 min；PBS沖洗，5 min×3次；滴加生物素山羊抗兔IgG，37℃孵育15 min；PBS沖洗，5min×3次；顯色劑顯色3 min（DAB）；自來水充分沖洗，復染，脫水，透明，封片；以細胞質內出現棕黃色顆粒為陽性結果。

1.2.5 Western blot法檢測VEGF、Calpain2蛋白定量表達 提取4組標本總蛋白，并計算出上樣體積。變性后SDS聚丙烯酰胺凝膠垂直電泳，電轉膜，5%脫脂奶粉封閉，TBST洗膜，然后加入VEGF及Calpain2一抗（1∶500）4℃孵育過夜，TBST洗膜后加入辣根過氧化酶標記的IgG二抗（1∶6 000）室溫孵育2 h，應用超敏ECL化學發光試劑盒曝光，以Tubulin蛋白作為內參照。采用Image Tool凝膠圖像分析系統進行分析。

1.3 統計學處理 應用SPSS 18.0統計軟件；計量資料以表示，多組比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD-t檢驗；P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 各組裸鼠移植瘤生長情況比較 腹腔內用藥15 d后，各組裸鼠體重、移植瘤體積比較見圖1、2。

圖1 各組裸鼠體重比較

由圖1可見，各組裸鼠體重比較差異無統計學意義（P＞0.05），裸鼠體重也未見明顯變化，即ART未表現出明顯的毒副反應。由圖2可見，各組裸鼠移植瘤體積比較有統計學差異（P＜0.05），兩兩比較亦有統計學差異（均P＜0.05），與空白對照組比較，60 mg/kg ART組、120 mg/kg ART組、240 mg/kg ART組裸鼠移植瘤體積均明顯縮小，抑瘤率分別約為37.2%、45.0%、58.1%，即ART表現出劑量依賴性的抑瘤作用。

圖2 各組裸鼠移植瘤體積比較

2.2 各組胃癌BGC-823細胞VEGF、Calpain2 mRNA表達水平比較 見表1。

由表1可見，4組胃癌BGC-823細胞VEGF、Calpain2 mRNA表達水平比較均有統計學差異（均P＜0.05），兩兩比較亦有統計學差異（均P＜0.05），與空白對照組比較，60 mg/kg ART組、120 mg/kg ART組、240 mg/kg ART組細胞VEGF mRNA相對表達水平均明顯下降，Calpain2 mRNA相對表達水平均升高，即VEGF mRNA相對表達水平隨ART藥物濃度升高而降低，而Calpain2 mRNA相對表達水平隨ART藥物濃度升高而升高。

表1 各組胃癌BGC-823細胞VEGF、Calpain2 mRNA表達水平比較

2.3 各組胃癌BGC-823細胞VEGF、Calpain2蛋白表達情況比較 見圖3-5。

圖3 各組胃癌BGC-823細胞VEGF蛋白表達情況比較（a：120mg/kg ART組；b：空白對照組；蘇木素染色，×200）

圖4 各組胃癌BGC-823細胞Calpain2蛋白表達情況比較（a：120mg/kg ART組；b：空白對照組；蘇木素染色，×200）

圖5 各組胃癌BGC-823細胞VEGF、Calpain2蛋白表達情況比較（a:空白對照組；b:60 mg/kg ART組；c:120 mg/kg ART組；d:240 mg/kg ART組）

由圖3、4可見，VEGF、Calpain2蛋白均表達于細胞質。由圖5可見，4組胃癌BGC-823細胞VEGF、Calpain2蛋白表達水平比較均有統計學差異（均P＜0.05），兩兩比較亦有統計學差異（均P＜0.05），與空白對照組比較，60 mg/kg ART組、120 mg/kg ART組、240 mg/kg ART組細胞VEGF蛋白相對表達水平（分別為0.78±0.02、0.62±0.01、0.29±0.01）均下降，Calpain2蛋白相對表達水平（分別為1.14±0.02、2.46±0.03、3.98±0.04）均升高，即VEGF蛋白相對表達水平隨ART藥物濃度升高而降低，而Calpain2蛋白相對表達水平隨ART藥物濃度升高而升高。

3 討論

Majno及Joris最早在同一細胞損傷中發現兩種不同的細胞形態學改變，細胞溶解與細胞腫脹，并將這兩種不同的死亡形態分別命名為凋亡與脹亡[6]。凋亡作為細胞死亡的方式已被廣泛接受，是迄今為止研究最深入的細胞死亡方式；而細胞脹亡在腫瘤的發生、發展中也占有重要地位。周晉等[7]報道青蒿素能使人白血病細胞株NB4、K562和原代APL細胞發生脹亡，Du等[8]報道ART能通過活性氧損傷機制誘導胰腺癌細胞發生脹亡。筆者團隊經前期實驗發現ART可在體外誘導胃癌細胞發生脹亡[4-5]。本實驗研究在前期成果的基礎上，發現ART在胃癌移植瘤模型體內產生了劑量依賴性的抑瘤作用，60 mg/kg ART組、120 mg/kg ART組、240 mg/kg ART組裸鼠移植瘤體積均縮小，抑瘤率分別約為37.2%、45.0%、58.1%，且裸鼠未出現明顯的毒副反應。可見，ART有潛力發展成為一種通過細胞脹亡機制抑制胃癌細胞增殖的候選藥物，可以增強胃癌細胞的化療敏感性。

接著，本研究進一步通過分子生物學技術研究其可能作用機制。研究表明，細胞在缺氧的環境下，能量耗竭導致離子失衡（特別是鈣離子），激活鈣相關蛋白誘導細胞脹亡[9-10]。Calpain是一種鈣依賴性的中性蛋白酶，屬于半胱氨酸蛋白酶家族，能水解spectrin、paxillin及vinculin肌纖維蛋白，與細胞脹亡的發生密切相關[11]。Calpain抑制劑能夠抑制細胞發生脹亡，對細胞凋亡沒有抑制作用或抑制作用較弱。Calpain活性受細胞中鈣離子的濃度影響，鈣離子可以激活此蛋白，根據激活此種蛋白所需的鈣離子濃度，Calpain分為Calpain1（微摩爾級）和Calpain2（毫摩爾級）。Calpain1能在正常生理條件下發揮功能，而Calpain2則在病理條件下(如細胞內鈣超載)才能激活，引起細胞膜通透性增加進而使細胞發生脹亡[10]。筆者推測ART可能是通過誘導細胞缺氧，VEGF下降導致鈣離子超載，激活了Calpain2蛋白，從而誘導細胞發生脹亡。

為驗證這一假設，本研究通過RT-PCR、免疫組化及Western blot法檢測胃癌BGC-823細胞中VEGF、Calpain2的變化，結果顯示經ART作用后，VEGF的mRNA及蛋白相對表達水平隨藥物濃度升高而降低，而Calpain2的mRNA及蛋白相對表達水平則隨藥物濃度升高而升高。由此可知，ART抑制胃癌細胞的增殖、誘導其脹亡與VEGF表達下調及Calpain2表達上調有關。

綜上所述，ART在胃癌移植瘤模型體內通過細胞脹亡起劑量依賴性的抑瘤作用，該作用機制可能與下調VEGF的表達、上調Calpain2的表達有關。ART或可成為胃癌化療候選藥物，具有重要臨床價值。

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（本文編輯：李媚）

讀者·作者·編者

《浙江醫學》對醫學論文中有關實驗動物描述的要求

在醫學論文的描述中，凡涉及實驗動物者，在描述中應符合以下要求：（1）品種、品系描述清楚；（2）強調來源；（3）遺傳背景；（4）微生物學質量；（5）明確等級；（6）明確飼養環境和實驗環境；（7）明確性別；（8）有無質量合格證；（9）有對飼養的描述（如飼料型、營養水平、照明方式、溫度、溫度要求）；（10）所有動物數量準確；（11）詳細描述動物的健康狀況；（12）對動物實驗的處理方式有單獨清楚的交代；（13）全部有對照，部分可采用雙因素方差分析。

本刊編輯部

Effects of artesunate on transplanted human gastric cancer BGC-823 in nude mice

WANG Weiming,ZHOU Xiang,ZHENG Zhiqiang. Department of Hepatobiliary Surgery,the First Affiliated Hospital of Wenzhou Medical University,Wenzhou 325000,China

Artesunate Stomach neoplasms Nude mice model

2017-04-11）

10.12056/j.issn.1006-2785.2017.39.14.2017-802

溫州市科技計劃項目（Y20140105、Y20140111）

325000 溫州醫科大學附屬第一醫院肝膽外科(王維明）；溫州醫科大學附屬第二醫院腫瘤外科（周香、鄭志強）

王維明，E-mail：wwm_boy2010@163.com

【 Abstract】 Objective To investigate the effect of artesunate on transplanted human gastric cancer in nude mice. Methods Human gastric cancer BGC-823 cells were inoculated in nude mice.The tumor-bearing nude mice were treated with artesunate at a dose of 60,120,or 240 mg/(kg·d),i.p.for 15 d.The changes of body weights and tumor size were observed.The expression of VEGF and Calpain2 mRNA and proteins were detected by RT-PCR,immunohistochemical and Western Blot, respectively. Results Artesunate suppressed BGC-823 tumor growth in nude mice in a dose-dependent manner.The expression of VEGF mRNA and protein were decreased and the expression of Calpain2 mRNA and protein were increased in cancer cells of artesunate-treated nude mice,compared to control group (P＜0.05). Conclusion Artesunate induces a dose-dependent suppression of BGC-823 tumor growth in nude mice,which might be related to the down-regulation of VEGF and the up-regulation of Calpain2.