結直腸腺癌組織中EZH2、Caspase-3蛋白的表達變化及意義

張立成，周毅(天津市第三中心醫院，天津30070；天津市人民醫院)

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·臨床研究·

結直腸腺癌組織中EZH2、Caspase-3蛋白的表達變化及意義

張立成1，周毅2
(1天津市第三中心醫院，天津300170；2天津市人民醫院)

目的 觀察果蠅zeste基因增強子同源物2(EZH2)及半胱氨酸天冬氨酸蛋白水解酶3(Caspase-3)蛋白在結直腸腺癌組織中的表達變化，并進一步探索其意義。方法 收集結直腸腺癌組織100例份，同時收集相應癌旁(距癌組織邊緣>10 cm)正常組織100例份作為對照。分別采用免疫組化法、Western blotting法檢測癌及癌旁組織中EZH2及Caspase-3蛋白表達。結果 結直腸腺癌組織中EZH2蛋白表達高于癌旁正常組織(P<0.05)，EZH2蛋白表達與腫瘤發生部位、分化程度、臨床TNM分期及淋巴結轉移相關(P均<0.05)，與年齡、性別無關(P均>0.05)。結直腸腺癌組織中Caspase-3蛋白表達低于癌旁正常組織(P<0.05)。Caspase-3蛋白陽性表達與結直腸癌患者性別、發病年齡、患病部位無關(P均>0.05)，與組織分化程度、TNM分期、淋巴結轉移有關(P均<0.05)。結直腸腺癌組織中EZH2和Caspase-3蛋白表達呈負相關(r=-0.64，P<0.05)。結論 結直腸腺癌組織中EZH2蛋白呈高表達，Caspase-3蛋白呈低表達；EZH2可能通過下調Caspase-3表達，參與結直腸腺癌的發生發展。

結直腸癌；果蠅zeste基因增強子同源物2蛋白；細胞凋亡；半胱氨酸天冬氨酸蛋白水解酶3

結直腸癌是消化道常見腫瘤之一，在我國已成為發病率居第三位的惡性腫瘤[1]。每年新增結直腸癌患者達100萬例，病死率約占相關惡性腫瘤患者的9%[2]。結直腸腺癌受多種因素影響，多個基因參與疾病的發展。研究表明，結直腸癌生存率與患者身體上、心理上困擾有關[3]。GD-1基因已證明在結直腸癌患者中具有重要的腫瘤抑制活性[4]。盡管進行了大量的研究工作，然而結直腸腺癌發生的分子機制目前仍不明確。PI3K-Akt信號通路在人類癌癥的成因中扮演重要角色，與細胞增殖、分化、轉移和凋亡有關。果蠅zeste基因增強子同源物2 (EZH2)作為PcG基因家族的重要成員之一，亦參與PI3K-Akt信號通路，通過下調半胱氨酸天冬氨酸蛋白水解酶3(Caspase-3)表達促進腫瘤發生[5]。研究表明，EZH2在多種實體腫瘤組織中異常表達，如胰腺癌[6]等，EZH2可能與腫瘤細胞的侵襲、轉移有關。目前，關于EZH2 在結直腸腫瘤組織中表達的報道相對較少。Caspase-3作為PI3K-Akt信號通路的下游基因，在調控凋亡過程中發揮重要作用[7]。目前對于在結直腸腺癌組織中EZH2和Caspase-3間的相互作用機制尚不十分明確。2016年10月，我們通過免疫組化及Western blotting法，觀察EZH2、Caspase-3蛋白在結直腸腺癌組織的表達變化并探討其意義。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 收集2013年9月～2016年9月天津市第三中心醫院普外科和天津市人民醫院肛腸科手術切除臨床病理資料完整的結直腸腺癌組織100例份，患者男48例、女52例，年齡41～85歲(中位年齡63.8歲)，其中<50歲54例，≥50歲46例。腫瘤位于左半結腸52例，右半結腸48例；根據WHO大腸腺癌的組織學分級標準：高中分化66例，低或未分化34例；根據結直腸癌 TNM 分期系統：T1期36例，T2期32例，T3期17例，T4期15例。淋巴結轉移37例，無轉移63例。同時收集相應距癌組織邊緣>10 cm的癌旁正常組織100例份作為對照。病例均為首發腫瘤，經兩名病理醫師進行組織病理學檢查明確診斷，術前均未經行放、化療等輔助治療。

1.2 結直腸腺癌組織中EZH2、Caspase-3蛋白表達檢測 組織離體后立即浸入液氮，-80 ℃冰箱保存。結直腸腺癌組織和癌旁組織均經中性甲醛和石蠟包埋，制備3 μm厚切片，恒溫箱60 ℃內烤片4 h，4 ℃冰箱留存，行免疫組化染色。H2O2-甲醇液中15 min，PBS洗2 min×3次，加封閉液孵育10 min。棄去液體加兔抗人EZH2 多克隆抗體(1∶200)，Caspase-3 單克隆抗體(1∶100)，4 ℃過夜。PBS洗2 min×3次，加抗小鼠生物素化二抗孵育10 min，PBS洗2 min×3次。加HRP標記鏈親和素孵育10 min，PBS洗2 min×3次。DAB顯色、水洗、復染、脫水、透明、封片。免疫組化結果由兩位有經驗的病理學專家進行雙盲鑒定。每張切片于顯微鏡下選取5個視野，以細胞核出現棕黃色顆粒為陽性細胞。按照陽性細胞數的百分比和著色強度進行半定量積分判定：先于×40倍鏡下觀察表達情況，記錄著色強度，0分為細胞未著色，1分為淡黃色，2分為棕黃色，3分為棕褐色；再于×400倍鏡下記錄陽性細胞數的百分比，每個視野計數100個瘤細胞，得出陽性細胞的百分率(陽性細胞數/總的瘤細胞數)，陽性細胞數<5%為0分，5%～25%為1分，26%～50%為2分，51%～75%為3分，>75%為4分。著色強度與陽性細胞數得分乘積為染色指數(SI)，SI>4為陽性表達：SI≤4為陰性表達。取結直腸腺癌組織和癌旁組織中活化3 h的細胞，按常規方法提取蛋白質并用BCA法進行蛋白定量，十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)分離，轉膜、封閉，加一抗(β-actin 1∶1 000，兔抗鼠EZH2抗體1∶1 000，兔抗鼠Caspase-3抗體1∶1 000稀釋液，4 ℃孵育過夜。洗膜，加入二抗HRP 標記羊抗兔 IgG稀釋液(1∶2 000)，室溫下孵育2 h，用免疫熒光成像系統顯色，圖像分析軟件掃描條帶灰度值，Western blotting法計算兩種組織中蛋白表達相對定量，實驗重復3次。

1.3 統計學方法 采用SPSS19.0統計軟件。EZH2蛋白表達陽性率及其與臨床病理特征的關系采用χ2檢驗，EZH2和Caspase-3相關性分析采用Spearman相關分析法，兩組間比較采用t檢驗，多組間比較采用單因素方差分析(One-way ANOVA)，組內數據比較采用t檢驗。P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 胰腺癌組織中EZH2及Caspase-3蛋白表達及其與患者臨床病理特征的關系 胰腺癌組織、癌旁組織中EZH2蛋白陽性表達率分別為84%、6%，胰腺癌組織、癌旁組織中EZH2蛋白陽性表達率比較，P<0.05。EZH2蛋白陽性表達與結直腸癌患者性別、年齡無關(P均>0.05)，與患者腫瘤部位、組織分化程度、TNM分期、淋巴結轉移有關(P均<0.05)。Caspase-3蛋白在胰腺癌及癌旁組織中的陽性表達率分別為37%、92%，胰腺癌組織、癌旁組織中Caspase-3蛋白陽性表達率比較，P<0.05。Caspase-3蛋白陽性表達與結直腸癌患者性別、年齡、腫瘤部位無關(P均>0.05)，與組織分化程度、TNM分期、淋巴結轉移有關(P均<0.05)，見表1、表2。

表1 EZH2蛋白陽性表達與結直腸癌患者臨床病理特征的關系

表2 Caspase-3蛋白陽性表達與結直腸癌患者臨床病理特征的關系

2.2 結直腸癌患者癌組織中EZH2與Caspase-3蛋白表達的關系 Caspase-3蛋白與EZH2蛋白共同陽性例數為23例(23.00%)，共同陰性例數為6例(6.00%)。Spearman相關性分析顯示，EZH2與Caspase-3蛋白表達呈負相關(r=-0.64，P<0.01)。

3 討論

近年來，PcG基因家族成為研究的熱門基因之一，在多個生物學過程中發揮重要調節作用[8]。EZH2是PcG基因家族中的一員，PcG基因和TrxG相互拮抗則會引起功能失調，導致癌變。EZH2定位于人類7號染色體的q35區域，小鼠6號染色體位置上，是一種致癌基因[9]。既往研究表明，EZH2在多種實體腫瘤組織(如胰腺癌等)中異常表達，與預后差密切相關[6]。Mimori等[10]研究表明，結直腸癌病例中EZH2豐富表達。EZH2基因是Polycomb基因組的成員，參與表觀遺傳沉默和細胞周期調控，其表達與細胞增殖有密切關系。一項409例結直腸癌Ⅰ期和Ⅲ期患者的研究結果表明，EZH2表達與腫瘤細胞增殖有關[11]。盡管EZH2蛋白在結直腸腺癌中的表達不斷見諸報道，但目前EZH2在結直腸癌中的作用機制仍不清楚。

本研究結果顯示結直腸腺癌組織中EZH2蛋白陽性表達高于癌旁正常組織，差異有統計學意義。另外，EZH2蛋白表達與結直腸腺癌分化程度及分期密切相關，隨著分化程度增加而表達升高，差異有統計學意義。另外，左半結腸與右半結腸的EZH2蛋白表達亦有統計學差異，表明左右半結腸的癌變機制亦存在一定差異[12]。結直腸腺癌組織中Caspase-3蛋白表達低于癌旁正常組織，差異有統計學意義。Caspase-3蛋白表達與結直腸腺癌患者腫瘤部位無關，而與組織分化程度、TNM分期、淋巴結轉移有關。EZH2蛋白及Caspase-3蛋白的異常表達可作為臨床早期診斷結直腸腺癌的參考指標。

如前所述，EZH2基因表達與細胞增殖有關。然而Caspase-3作為參與細胞凋亡的重要基因，與EZH2相互作用機制尚不明確。Mimori等[10]研究表明EZH2高表達組結直腸腺癌患者預后顯著差于低表達組，而Fluge等[11]研究表明EZH2高表達與細胞增殖呈正相關，具有更好的無復發生存時間。本研究結果顯示，EZH2與Caspase-3表達呈相反的趨勢，高分化結直腸腺癌組織具有高表達的EZH2和低表達的Caspase-3。另外，Spearman相關性分析結果亦證明二者呈負相關關系。小干擾RNA下調人結腸癌細胞 中EZH2基因表達后，細胞凋亡比例增加，細胞增殖能力明顯降低[13]。本研究結果表明EZH2蛋白與結直腸腺癌細胞凋亡密切相關。

總之，結直腸腺癌組織中EZH2蛋白呈高表達，Caspase-3蛋白呈低表達；EZH2可能通過下調Caspase-3表達，進而影響腫瘤細胞的增殖，參與腫瘤的發生發展。

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周毅(E-mail:JJ＿158@126.com)

10.3969/j.issn.1002-266X.2017.25.015

R735.3

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1002-266X(2017)25-0048-03

2016-12-27)