基于損傷面積控制大鼠胰腺創傷模型的建立及意義

王海林，肖和達，鄧超，劉衛輝，湯禮軍，戴睿武(1西南醫科大學，四川瀘州 646000;成都軍區總醫院全軍普外中心)

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基于損傷面積控制大鼠胰腺創傷模型的建立及意義

王海林1,2，肖和達2，鄧超2，劉衛輝2，湯禮軍2，戴睿武1,2
(1西南醫科大學，四川瀘州 646000;2成都軍區總醫院全軍普外中心)

目的 探討建立一種新型大鼠單純胰腺創傷模型，并基于損傷面積評估其傷情變化。方法 將大鼠隨機分為2組，采用自主研發多功能撞擊儀的3 cm2(3 cm2致傷面積組)和6 cm2(6 cm2致傷面積組)撞擊頭，分別擠壓各組處于開腹狀態的胰腺，使之在400 kPa的壓強下形成不同面積的損傷，并設置對照組；建模24 h后觀察各組大鼠存活率、一般情況、大體病理和組織病理學改變，并檢測血鉀、血鈣的濃度和血清、腹水中淀粉酶及脂肪酶的活性。結果 與對照組比較，3 cm2和6 cm2致傷面積組均能形成明顯的損傷(P<0.05)，其中，與3 cm2致傷面積組比較，6 cm2致傷面積組損傷更顯著(P<0.05)。與3 cm2致傷面積組相比,6 cm2致傷面積組大鼠存活率、血鉀及血鈣水平更低(P均<0.05)，一般情況更差，損傷性病理改變的范圍及程度更大，血清淀粉酶、脂肪酶更高(P均<0.05)。結論 成功建立了一種基于損傷面積控制的大鼠胰腺創傷模型。該模型簡單、有效、可控性及可重復性好,適合用于傷情演化機制和創傷施救等方面的研究。

胰腺創傷模型；損傷面積；傷情評估；大鼠

胰腺創傷的發病率占腹部外傷的1%～3%[1]，隨著近年來交通事故、工業事故的頻發，胰腺創傷的發生呈逐年上升趨勢。胰腺創傷因其多發性、嚴重性、隱匿性、病死率高等特點，而成為創傷外科領域亟待研究的焦點[2]。而目前關于胰腺創傷的研究主要集中于診斷治療方面[3，4]，對于創傷后生理病理等變化的基礎性研究欠缺。我們擬建立一種新型穩定的單純大鼠胰腺創傷模型，為研究胰腺創傷后的各方面生理機能變化提供合適的模型條件。

1 材料與方法

1.1 材料 健康封閉群SD大鼠50只，成年雄性，無特定病原體(SPF)級，體質量(250±10)g，購于成都達碩實驗動物有限公司；多功能動物撞擊儀(自行研發，已獲授權專利，主要由儲能換能裝置、簡便多功能撞擊裝置和撞擊參數測量裝置等部件組成，可準確控制撞擊的接觸面積和撞擊力的大小)；動物手術器械包、水合氯醛購于四川生工科技有限公司；萬分之一天平由成都軍區總醫院中心實驗室提供；HE染色試劑盒購于北京索萊寶科技有限公司；血鉀、血鈣、淀粉酶、脂肪酶測試盒均購自南京建成生物工程研究所。

1.2 動物分組與建模方法 參照我們前期的實驗研究，在400 kPa的致傷壓強下能建立穩定的大鼠胰腺創傷模型[5～7]。取SD大鼠50只，隨機分為3組，A、B組每組20只，C組10只。A組接受3 cm2/12 kg的擠壓參數(即400 kPa壓強)，B組接受6 cm2/24 kg的擠壓參數(壓強同A組)，C組為假手術組。各組術前常規禁食水12 h，采用4%水合氯醛按1 mL/100 g經腹腔注射麻醉，麻醉滿意后固定，剃毛，消毒，取上腹部正中線處開腹，以脾門和門靜脈處為界限，分離胰腺與腹腔周圍組織；A、B組將胰腺置于墊板和撞擊頭之間，調整預設定的擠壓應力參數值，用已消毒的不同擠壓面積的撞擊頭垂直擠壓胰腺，擠壓時間均為0.5 s。C組僅用棉簽輕輕按壓翻動胰腺數次，時間同A、B組。建模后各組大鼠均經皮下注射生理鹽水補液10 mL,造模后恢復供食水，置于陰涼通風干燥適溫條件，連續觀察24 h，隨后經腹主動脈采血處死，留取各標本待檢相關指標。

1.3 觀察指標 ①存活率和一般情況：建模后，連續觀察24 h，記錄各組存活只數和精神、活動、飲食等一般情況的變化。②大體病理改變：建模后24 h開腹觀察大體病理改變，觀察腹水性質并抽取計量，留置腹水于-80 ℃保存供生化檢測；以門靜脈和脾門為界，分離并取出完整胰腺，置于萬分之一天平稱量胰腺濕重。③組織病理學變化：取上述胰腺組織適量，用4%多聚甲醛固定24 h,常規脫水，石蠟包埋，切片(厚度6 μm)，HE染色，中性樹膠封片，置于光學顯微鏡下觀察組織病理學變化；委托不知實驗分組情況的同一病理醫師，按照Dai等[1]的標準進行病理程度評分，每張切片取10個高倍視野，單張切片最終的評分為10個視野評分的均值。④生化指標：經腹主動脈采血，離心后留置血清，存于-80 ℃冰箱，采用分光光度法，參照試劑盒說明書，檢測血鉀(K+)、鈣(Ca2+)的濃度及血清和腹水中淀粉酶(AMS)、脂肪酶(LPS)活性。

2 結果

2.1 各組存活率和一般情況變化比較 A組全部成功建模，連續觀察至24 h,死亡6只，存活14只大鼠精神萎靡，呈半被動體位，頭部僅能間斷上抬，對外界刺激(觸摸)反應一般，動態觀察少量進食；B組其中1只因造模時腸系膜血管損傷出血死亡，余下19只成功建模，24 h后死亡8只，存活11只大鼠精神及活動與A組相似，呈被動體位，略能抬頭，對觸摸反應差，連續觀察幾乎無進食；C組1只因麻醉致死，余9只24 h后全部存活。建模后10～12 h觀察可見精神漸恢復、活動自如，開始自主食水。

2.2 各組大體病理改變及腹水量、胰腺濕重比較 A、B組大鼠胰腺擠壓后，胰腺迅速充血、腫脹，少量滲出，局部現散在出血點，胰腺組織挫裂，B組較A組損傷面積范圍更大；C組胰腺呈淡紅色，與周圍組織界限分明，未見明顯異常。建模24 h后，開腹可見：A、B兩組胃明顯擴張伴潴留，胰腺較撞擊時腫脹更加明顯，呈粉紅色，局部散在出血壞死灶，有肉眼可見的淡紅色血性腹水形成，腸系膜及腸壁擴張充血、腫脹、滲出明顯，腸系膜根部等處的脂肪組織有壞死液化及皂化斑；C組與前述比較無明顯變化。傷后24 h A、B、C組腹水量分別為(4.57±0.51)、(7.13±0.42)、0 mL，胰腺濕重分別為(1.35±0.10)、(1.53±0.15)、(0.65±0.05)g。A、B組腹水量及胰腺濕重與C組比較，P均<0.05；A、B組腹水量及胰腺濕重比較，P均 <0.05。

2.3 各組組織病理學變化及生化指標比較 建模后24 h,光鏡所見：①胰腺實質細胞和間質出現不同程度充血水腫、壞死(核固縮、核碎裂、核溶解)等；②有輕度炎細胞浸潤，A、B組間差異無統計學意義；③組織內見大量紅細胞滲出；④腺體形態改變，部分呈空泡狀，大小不一，對照組鏡下胰腺組織未見明顯病變。傷后24 h各組病理評分及生化指標(血K+、Ca2+濃度，血清、腹水中AMS及LPS活性)比較見表1。

表1 傷后24 h各組病理評分及生化指標比較

注：與C組比較，▲P<0.05；與A組比較，★P<0.05。

3 討論

胰腺位于脊柱前方，外力作用于上腹部時，由于脊柱擠壓作用，常加重胰腺損傷。胰腺創傷后漏診和誤診率高，且傷后發生胰漏、出血等并發癥的幾率較大[8]。

建立成功的創傷模型有兩大主要標準：一是保證創傷后實驗動物在研究時間范圍內存活；二是目標傷情的形成[9]。我們在前期研究基礎上，已驗證了400 kPa，1 cm2的撞擊參數能使大鼠胰腺明顯創傷且存活率較高[5～7]。然而由于建立動物模型的最終目的是盡可能模擬與臨床創傷相似的病變過程[10]，故上述動物模型存在不能代表胰腺大面積創傷的不足之處。針對這一點，我們設計了本實驗中3、6 cm2的胰腺大面積擠壓傷模型，同時由于以擠壓為主的致傷模式產生的沖擊小，與快速撞擊建模方式相比，在致傷機制上主要表現為血管損傷較小而胰腺組織損傷更重，大鼠不易因大出血致死，從而使該模型具有致傷因素純化、損傷范圍可控、穩定性好等特點。

本研究結果顯示，A、B組致傷后24 h，大鼠的存活率及一般情況差于C組，B組較A組的死亡率有所增加。腹水計量和胰腺濕重在A、B組間有統計學差異，可見隨著撞擊面積的增大，胰腺組織出血、壞死加重。組織病理評分B組高于A組。形態學方面的諸多改變表明胰腺創傷建模面積越大，損傷越顯著。血鉀、血鈣濃度等生化指標組間比較均有統計學差異，且隨創傷面積增加，血鉀、血鈣濃度均逐漸降低。可能原因：胰腺創傷后腹水的產生，丟失了較多的K+、Ca2+，導致血鉀、血鈣均減少；此外，胰腺細胞損傷后釋放大量胰酶，胰酶作用并分解胰周脂肪組織，后者隨后與Ca2+結合成皂化斑，這與前述大體病理變化結果吻合，此為血鈣減低的又一可能原因。

胰腺創傷后功能學上的變化可借助胰酶活性檢測。外力擠壓胰腺致腺泡細胞損傷，細胞內的消化酶原被激活和釋放，造成胰腺的進行性損傷，因此，測定胰酶活性有助于預示胰腺損傷后的病情演化情況[11]。本實驗結果表明，在創傷后24 h，A、B組血清、腹水中的AMS均顯著高于C組，差異有統計學意義，而A、B組間差異無統計學意義；A、B組血清LPS與C組比較差異有統計學意義，A、B組血清LPS比較差異有統計學意義，而A、B組腹水LPS比較差異無統計學意義。因此我們認為，胰腺創傷后24 h，可根據血清AMS活性變化來判斷是否存在損傷；由于LPS在實驗組間具有特異性，可根據血清LPS活性評估損傷的嚴重程度；腹水AMS、LPS可作為輔助診斷指標。

綜上所述，本研究在400 kPa的瞬時擠壓參數下，成功建立了一種基于損傷面積控制的大鼠胰腺創傷模型，本模型能夠單純模擬胰腺大面積創傷，操作簡單、致傷因素單一、可控性及可重復性好，能為進一步傷情分析和創傷救治等研究提供良好的模型基礎。

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國家自然科學基金資助項目(81001695)；四川省科技廳應用基礎研究項目(2013JY0046)。

戴睿武(E-mail：rwdai@163.com)

10.3969/j.issn.1002-266X.2017.25.012

R576

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1002-266X(2017)25-0040-03

2017-02-08)