低劑量順鉑與紫杉醇聯合用藥對結直腸癌細胞遷移、凋亡的影響及機制

張國玲，張秀麗，張鑫( 天津醫學高等?？茖W校，天津 300； 武警后勤學院附屬醫院)

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·基礎研究·

低劑量順鉑與紫杉醇聯合用藥對結直腸癌細胞遷移、凋亡的影響及機制

張國玲1，張秀麗1，張鑫2
(1 天津醫學高等?？茖W校，天津 300222；2 武警后勤學院附屬醫院)

目的 研究低劑量順鉑與紫杉醇聯合用藥對結直腸癌細胞株LOVO和SW480遷移及凋亡的影響，并探討其可能機制。方法 將結直腸癌細胞株LOVO和SW480各分為五組，對照組加入PBS，順鉑組加入4 μg/mL順鉑，紫杉醇組加入200 μg/mL紫杉醇，聯合1組加入4 μg/mL順鉑與200 μg/mL紫杉醇，聯合2組加入1 μg/mL順鉑+200 μg/mL紫杉醇，通過細胞劃痕實驗測算各組細胞劃痕愈合率，通過流式細胞儀檢測各組細胞凋亡情況，通過Western blotting法檢測細胞周期蛋白CyclinD1和細胞凋亡相關蛋白Cleaved Caspase-3表達。結果 對照組、順鉑組、紫杉醇組LOVO細胞劃痕愈合率分別為(82.50±1.58)%、(10.00±3.65)%、(15.00±4.90)%，對照組與順鉑組、紫杉醇組比較，P均<0.001。對照組、順鉑組、紫杉醇組LOVO細胞凋亡率分別為(3.16±2.04)%、(88.81±2.74)%、(57.32±3.98)%，對照組與順鉑組、紫杉醇組比較，P均<0.01。對照組、順鉑組、紫杉醇組SW480細胞劃痕愈合率分別為(87.50±2.19)%、(17.00±2.67)%、(22.00±5.92)%，對照組與順鉑組、紫杉醇組比較，P均<0.01。對照組、順鉑組、紫杉醇組SW480細胞凋亡率分別為(2.08±3.01)%、(76.40±3.12)%、(40.3±4.84)%，對照組與順鉑組、紫杉醇組比較，P均<0.01。聯合1組處理24 h后，LOVO和SW480細胞幾乎全部死亡；聯合2組處理24 h后，LOVO和SW480細胞凋亡率高達(98.65±5.06)%、(91.4±4.87)%，與對照組相比，P均<0.01；順鉑組、紫杉醇組、聯合1組、聯合2組CyclinD1表達均降低，Cleaved Caspase-3蛋白表達升高，順鉑組、紫杉醇組分別與聯合1組、聯合2組比較，P均<0.05。結論 低劑量順鉑與紫杉醇聯合可顯著抑制結直腸癌細胞株LOVO和SW480的遷移，并誘導細胞凋亡；其機制可能與聯合用藥降低細胞周期蛋白CyclinD1表達，上調細胞凋亡相關蛋白Cleaved Caspase-3蛋白表達有關。

結直腸癌；順鉑；紫杉醇；細胞遷移；細胞凋亡；細胞周期素D1；半胱氨酸蛋白酶3

結直腸癌發病率居全球第四位[1]，易發生遠處轉移，病死率高。順鉑和紫杉醇是目前最常見的治療腫瘤化療藥物，對肺細胞癌[2]、卵巢癌[3]、膀胱癌[4]、鱗狀細胞癌[5]及淋巴瘤[6]等均有較好的治療效果，但使用一段時間后由于腫瘤細胞耐藥性增強而療效受到一定影響。細胞周期相關蛋白調節失控與腫瘤的發生發展及耐藥密切相關。細胞周期素D1(CyclinD1)是細胞周期的重要成員之一，調控細胞由G1期向S期的過渡，CyclinD1活性上調見于多種惡性腫瘤的發生發展過程。半胱氨酸蛋白酶(Caspase)是一組在胞質中存在而結構上與半胱氨酸相關的蛋白酶，可特異性地斷開天冬氨酸殘基的肽鍵。Caspase-3是決定細胞凋亡必需的蛋白酶，國內外大量研究表明其活性形式Cleaved Caspase-3的表達上調與腫瘤細胞凋亡密切相關[7～9]?，F將順鉑和紫杉醇聯用處理結直腸癌LOVO和SW480細胞，檢測細胞遷移能力和細胞凋亡活性的改變，并分析藥物作用前后細胞遷移能力和細胞凋亡改變的可能分子生物學機制，為解決臨床腫瘤患者順鉑或紫杉醇耐藥提供實驗基礎。

1 材料與方法

1.1 材料 人結直腸癌細胞株LOVO和SW480均購于美國ATCC公司，細胞培養液、血清、胰酶及抗生素等均購自美國Gibco公司，將兩種細胞培養于含10% FBS的RPMI1640培養液中，置于37 ℃、5% CO2、飽和濕度條件下培養。每2～3 d更換培養液1次，待細胞生長融合率達到80%左右時，用0.25%胰蛋白酶消化，按1∶2進行傳代培養。順鉑(C2210000)和紫杉醇(T7402)均購自美國Sigma Arich公司，避光低溫保存。CyclinD1抗體(2926s，CST)、Cleaved Caspase-3抗體(9664s，CST)及β-actin及A4sse 抗體(4970s，CST)均購自美國 Cell signaling科學技術公司，細胞凋亡試劑盒及流式細胞儀均購自美國 Millipore 公司，Western blotting相關實驗設備購自美國BIO-RAD公司。

1.2 細胞劃痕愈合率測算 進行細胞劃痕實驗。取對數生長期細胞，將其均分為3份，待細胞長至70%～80%密度時隨機分為五組，對照組加入PBS，順鉑組加入4 μg/mL順鉑，紫杉醇組加入200 μg/mL紫杉醇，聯合1組加入4 μg/mL順鉑與200 μg/mL紫杉醇，聯合2組加入1 μg/mL順鉑+200 μg/mL紫杉醇，24 h后換液去除藥物。每隔48 h換液1次，待藥物處理結束后將細胞用胰酶消化并鋪于12孔板內，6 h后開始劃痕并計時為0 h，然后在6、24及48 h時分別照相。獲取各組細胞同一部位不同時點的劃痕寬度，根據“劃痕愈合率(%)=(0 h劃痕寬度-x h劃痕寬度)/0 h劃痕寬度×100%”的公式，計算相應時點細胞劃痕愈合率。

1.3 細胞凋亡率檢測 將各組細胞處理、消化、收集、計數后，取1 mL細胞并加入20 μL Annexin V避光染色10 min，再加入10 μL PI 于室溫下避光孵育5 min;上流式細胞儀檢測熒光強度，計算各組細胞凋亡率。

1.4 癌組織中CyclinD1和Cleaved Caspase-3蛋白表達檢測 采用Western blotting法。將各組細胞處理、消化、收集后，以冰冷PBS溶液洗滌2次，加入500 μL細胞裂解液，置于冰上裂解30 min，4 ℃ 12 000 g離心20 min，吸取上清液，用BCA法測定蛋白濃度。每個樣本取30 μg上樣于SDS-PAGE凝膠，經電泳分離后，PVDF膜轉膜；膜用含5%脫脂牛奶封閉60 min，加入一抗CyclinD1、Cleaved Caspase-3和β-Caspase(均為1∶1 000稀釋)，4 ℃過夜，經TBST洗膜5 min，重復洗3次，辣根過氧化酶標記的二抗(1∶1 000)室溫孵育1 h后，TBST洗膜3次，每次10 min，ECL發光劑曝光，顯影。影像軟件Smart View分析各蛋白的相對表達量。

2 結果

2.1 五組LOVO和SW480細胞劃痕愈合率及細胞凋亡率比較 見表1。對照組、順鉑組、紫杉醇組LOVO細胞劃痕愈合率分別為(82.50±1.58)%、(10.00±3.65)%、(15.00±4.90)%，對照組與順鉑組、紫杉醇組比較，P均<0.01。對照組、順鉑組、紫杉醇組LOVO細胞凋亡率分別為(3.16±2.04)%、(88.81±2.74)%、(57.32±3.98)%，對照組與順鉑組、紫杉醇組比較，P均<0.01。對照組、順鉑組、紫杉醇組SW480細胞劃痕愈合率分別為(87.50±2.19)%、(17.00±2.67)%、(22.00±5.92)%，對照組與順鉑組、紫杉醇組比較，P均<0.001。對照組、順鉑組、紫杉醇組SW480細胞凋亡率分別為(2.08±3.01)%、(76.40±3.12)%、(40.30±4.84)%，對照組與順鉑組、紫杉醇組比較，P均<0.01。聯合1組處理24 h后，LOVO和SW480細胞幾乎全部死亡，將處理時間調整至12 h，移除藥物后個別細胞仍可貼壁生長，但48 h后細胞全部死亡。聯合2組處理24 h后，LOVO和SW480細胞凋亡率高達(98.65±5.06)%、(91.4±4.87)%，但移除藥物后，細胞可完全恢復。聯合1組、聯合2組細胞凋亡率與對照組相比，P均<0.01。

表1 五組LOVO和SW480細胞劃痕愈合率及細胞凋亡率比較

2.2 五組LOVO和SW480細胞中CyclinD1、Cleaved Caspase-3蛋白表達比較 順鉑組、紫杉醇組、聯合1組、聯合2組CyclinD1表達均降低，Cleaved Caspase-3蛋白表達升高，順鉑組、紫杉醇組分別與聯合1組、聯合2組比較，P均<0.05。見表2。

表2 五組LOVO和SW480細胞中CyclinD1、CleavedCaspase-3蛋白表達比較

3 討論

順鉑結構上是由二價鉑同兩個氯原子和兩個氨分子結合的重金屬絡合物，類似于雙功能烷化劑，屬于細胞周期非特異性藥物，可抑制DNA的復制過程，并損傷其細胞膜上某些膜結合蛋白的結構，有較強的廣譜抗癌作用。目前療效最顯著的是與VP-16聯合(EP方案)，為治療肺癌的一線化療方案。

紫杉醇抗癌的主要作用機制是通過促進微管蛋白聚合抑制微管解聚,保持微管蛋白穩定,抑制細胞有絲分裂從而調控腫瘤細胞增殖。目前臨床已將紫杉醇與異環磷酰胺、氟尿嘧啶、阿霉素、VP-16等聯用于治療各種惡性腫瘤患者，且療效顯著。研究表明，順鉑聯合紫杉醇可用于非小細胞肺癌[10]、晚期食管鱗狀細胞癌、上皮性卵巢癌及浸潤性乳腺癌等惡性程度較高的腫瘤患者臨床治療。但順鉑聯合紫杉醇治療結直腸癌的報道較少，可能與二者聯合后的藥物不良反應增加有關。本研究中將單一處理劑量的二者劑量疊加后聯合處理LOVO和SW480細胞導致細胞幾乎全部死亡，甚至降低藥物作用時間亦引起細胞不可恢復性死亡，表明二者聯合處理腫瘤細胞的毒性作用較大。本研究探索性地將低劑量順鉑聯合紫杉醇處理結直腸癌LOVO和SW480細胞，通過細胞劃痕實驗證實經二者聯合處理后細胞遷移能力明顯減弱，差異有統計學意義。提示低劑量順鉑和紫杉醇聯合處理腫瘤細胞可抑制腫瘤細胞遷移并誘導細胞凋亡。

細胞周期的調節失控與腫瘤發生發展密切相關。細胞周期蛋白(Cyclins)、周期蛋白依賴性激酶(CDKs)及周期蛋白依賴性激酶抑制物(CDKIs)對細胞周期進行嚴格調控。CyclinD1蛋白通過調控細胞由G1期向S期的過渡而調節細胞生長。目前已知CyclinD1蛋白在乳腺癌、結直腸癌、肺癌、內分泌腫瘤和卵巢癌等多種惡性腫瘤中均表達上調，CyclinD1蛋白高表達對腫瘤細胞的遷移和腫瘤患者生存預后均有重要影響，因此，CyclinD1可能成為腫瘤治療的有效靶點。本研究結果顯示,順鉑與紫杉醇均可下調結直腸癌LOVO細胞中CyclinD1蛋白表達，且低劑量順鉑聯合紫杉醇處理LOVO細胞明顯較單一用藥更能降低CyclinD1蛋白表達，表明二者在調控細胞周期時具有協同作用。

Caspase是一組在胞質中存在的結構上與半胱氨酸相關的蛋白酶，可特異性斷開天冬氨酸殘基的肽鍵，從而誘導細胞凋亡。Caspase家族成員較多，已鑒定了11種不同的Caspase在人類細胞發生發展過程中發揮重要作用，根據其蛋白酶序列的同源性可分為3個亞族:Caspase-1亞族包括Caspase-1、4、5、11;Caspase-2亞族包括Caspase-2、9; Caspase-3亞族包括Caspase-3、6、7、8、10。其中起細胞凋亡執行者作用的主要是Caspase-3亞族，即Caspase-3,6,7。另外組織蛋白酶(Cathepsin)亦是半胱氨酸蛋白酶超家族的成員，主要分布于溶酶體內，參與生物體內某些前體蛋白的修飾。Caspase-3誘導細胞凋亡的實質是其活性形式Cleaved Caspase-3蛋白表達上調，促使其下游的Rho相關卷曲螺旋形成蛋白激酶、DNA斷裂因子40及APP蛋白等表達活性上調，以上蛋白通過作用于細胞膜引起細胞膜皺縮，磷脂雙分子層結構松散從而導致細胞凋亡。本研究結果提示順鉑與紫杉醇均可引起結直腸癌LOVO細胞中Cleaved Caspase-3蛋白表達上調，并且低劑量順鉑聯合紫杉醇處理LOVO細胞明顯較單一用藥更能增強Cleaved Caspase-3蛋白表達，表明二者在誘導細胞凋亡時具有協同作用。

綜上所述，低劑量順鉑與紫杉醇聯合用藥可更好地抑制結直腸癌LOVO和SW480細胞遷移并誘導細胞凋亡，其機制可能與聯合用藥下調細胞周期蛋白CyclinD1表達，上調細胞凋亡相關蛋白Cleaved Caspase-3蛋白表達有關。

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