甲基阿魏酸對CCl4誘導肝纖維化大鼠肝臟氧化應激損傷和細胞外基質積聚的影響

李辰，黎瑩，李麗，楊成芳,鐘毓娟，吳丹，石琳，陳莉，李勇文(桂林醫學院，廣西桂林 541000)

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甲基阿魏酸對CCl4誘導肝纖維化大鼠肝臟氧化應激損傷和細胞外基質積聚的影響

李辰，黎瑩，李麗，楊成芳,鐘毓娟，吳丹，石琳，陳莉，李勇文
(桂林醫學院，廣西桂林 541000)

目的 探討甲基阿魏酸對四氯化碳(CCl4)誘導肝纖維化大鼠肝臟氧化應激損傷和細胞外基質積聚的影響。方法 將60只雄性成年SD大鼠隨機分為正常組、模型組、甲基阿魏酸高、中、低劑量組，用CCl4復制肝纖維化模型，甲基阿魏酸高、中、低劑量組分別給予20、10、5 mg/kg甲基阿魏酸灌胃。生化分析法測定血清ALT、AST及肝組織中丙二醛(MDA)、超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)、過氧化氫酶(CAT)水平。ELISA法檢測血清Ⅲ型前膠原(PCⅢ)、Ⅳ型膠原(Ⅳ-C)、透明質酸(HA)、層黏連蛋白(LN)含量。RT-PCR法和Western blotting法分別檢測肝組織中α-SMA、PCⅠ mRNA及蛋白表達。結果 與正常組比較，模型組大鼠ALT、AST、MDA及PCⅢ、Ⅳ-C、HA、LN含量升高(P均<0.01)，CAT、GSH-Px及SOD活性降低(P均<0.01)，肝脾指數升高(P<0.01)，有明顯的肝纖維化特征，肝組織中α-SMA和PCⅠ mRNA及蛋白表達增強(P均<0.01)。而甲基阿魏酸高、中、低劑量組與模型組比較，ALT、AST、MDA及PCⅢ、Ⅳ-C、HA、LN降低(P均<0.01)，CAT、GSH-Px及SOD活性升高(P均<0.01)，肝脾指數降低(P<0.01)，肝組織中α-SMA、PCⅠ mRNA及蛋白表達降低(P均<0.01)。結果 甲基阿魏酸可有效改善CCl4誘導肝纖維化大鼠的肝臟氧化應激損傷，減少細胞外基質的積聚，減輕肝纖維化程度。

肝纖維化;甲基阿魏酸；四氯化碳；大鼠

肝纖維化指肝臟細胞外基質(ECM)過量堆積致組織正常功能結構發生異常改變的嚴重病理過程。長期肝損傷導致生長因子、蛋白水解酶、血管生成因子和纖維細胞因子等持續產生，最終導致ECM的過度積累，形成包圍于肝細胞周圍的瘢痕寬帶組織，并可致門靜脈高壓及其并發癥，嚴重損害肝功能[1]。研究發現，α-平滑肌肌動蛋白(α-SMA)高表達是肝星狀細胞(HSC)活化的重要標志，激活的HSCs可分泌大量ECM，在嚴重損傷作用下，ECM的產生大于降解，即引起肝纖維化[2]。ECM蛋白的主要成分是Ⅰ型前膠原(PCⅠ)，膠原蛋白在抑制性蛋白水解作用下連接成膠原纖維導致過量的ECM無法清除，最終形成肝纖維化[3]。甲基阿魏酸(化學名：咖啡酸二甲醚)是從廣西特色中草藥蟬翼藤中提取的單體化合物[4]，蟬翼藤具有抗炎、增強免疫功能、抗病毒等活性[5]。龐文簫等[6]研究初步顯示甲基阿魏酸有一定的保肝作用。2016年7月～2017年1月，我們采用四氯化碳(CCl4)誘導大鼠肝纖維化模型，研究甲基阿魏酸對CCl4誘導肝纖維化大鼠肝臟氧化應激損傷和ECM積聚的影響。

1 材料與方法

1.1 材料 SPF級雄性SD大鼠60只，體質量180～220 g，由桂林醫學院實驗動物中心提供[實驗動物使用許可證號：SCXK(桂)2016-0050]。大鼠飼養于桂林醫學院實驗動物中心內，房間溫度18～24 ℃,濕度60%，12 h照明，12 h黑暗，清潔籠子隔天一次。使用標準維持飼料，蒸餾水。甲基阿魏酸(美國Sigma公司)；四氯化碳(CCl4,汕頭市西隴化工有限公司)；丙氨酸氨基轉移酶(ALT)、天冬氨酸氨基轉移酶(AST)、丙二醛(MDA)、超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)、過氧化氫酶(CAT)、Ⅲ型前膠原(PCⅢ)、Ⅳ型膠原(Ⅳ-C)、透明質酸(HA)、層黏連蛋白(LN)試劑盒均購自南京建成生物工程研究所；鼠抗α-SMA、PCI、β-actin抗體，山羊抗鼠二抗(中杉金橋)；DYY-6C雙穩定時電泳儀(北京六一生物科技有限公司)；MLDEL680型酶標儀、Chemi Doc型凝膠成像系統(美國BIO-RAD公司)；752型紫外可見分光光度計(上海菁華科技儀器有限公司)；TGL-16B型離心機(上海安亭科學儀器廠)；5424R臺式冷凍離心機(德國Eppendorf公司)。

1.2 動物分組、造模及干預 將60只雄性成年SD大鼠適應性飼養1周，隨機分為正常組、模型組、甲基阿魏酸高、中、低劑量組各12只，模型組和甲基阿魏酸高、中、低劑量組按體質量3 mL/kg灌胃給予50%CCl4橄欖油溶液制備肝纖維化模型，正常組給予等體積橄欖油，1周2次，連續6周。第7周起，模型組大鼠不再給予CCl4，甲基阿魏酸高、中、低劑量組分別灌胃20、10、5 mg/kg的甲基阿魏酸，每日1次，連續2周。實驗期間各組大鼠均給予相同標準的飼料和蒸餾水，并觀察記錄其一般狀況。

1.3 肝臟、脾臟指數測算及病理變化觀察 末次給藥后，禁食不禁水12 h。大鼠處死前稱體質量，取肝臟和脾臟，在濾紙上輕輕拭干后立即稱重，記錄肝重和脾重。各組均取肝葉中部用甲醛溶液固定，HE染色，觀察其病理變化。肝臟指數(%)=肝臟質量(mg)/體質量(g)×100%。脾臟指數(%)=脾臟質量(mg)/體質量(g)×100%。

1.4 大鼠血清ALT、AST及肝組織中CAT、GSH-Px、SOD及MDA水平檢測 采用生化分析法。腹主動脈采血，將全血靜置2 h，4 000 r/min離心10 min，分離血清。按照試劑盒說明測定血清ALT、AST活性；取大鼠肝臟相同部位組織制備肝勻漿，按照試劑盒說明測定大鼠肝組織CAT、GSH-Px、SOD及MDA水平。

1.5 大鼠血清中PCⅢ、Ⅳ-C、HA、LN檢測 采用ELISA法。按ELISA試劑盒提供說明書操作，酶標儀檢測各組大鼠血清中PCⅢ、Ⅳ-C、HA、LN水平。

1.6 肝臟α-SMA和PCI mRNA表達檢測 采用RT-PCR法。取肝臟組織約100 mg，按照天根總RNA提取說明書，采用TRIzol法抽提肝臟組織總RNA。用核酸蛋白測定儀測定RNA含量及純度，OD260/OD280在1.8～2.0。依據試劑盒說明書，將總RNA逆轉錄成cDNA。查找基因序列并設計引物，以β-actin為內參。反應條件:94 ℃預變性4 min，94 ℃變性30 s，45～68 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，共反應35個循環，最終產物72 ℃，10 min。反應結束后分別取10 μL產物及5 μL DNA Marker進行1.5%瓊脂糖凝膠電泳。凝膠成像系統檢測灰度值，ImageLab軟件進行分析。

1.7 肝臟α-SMA和PCⅠ蛋白表達檢測 采用Western blotting法。取各組大鼠肝組織約100 mg，剪碎，置于EP管中。加入配好的含有濃度為1 mmol/L PMSF的1 mL RIPA蛋白裂解液。用玻璃勻質器勻漿，充分裂解后，冰上靜置5 min。冷凍離心，13 000 r/min，離心10 min。取上清，BCA法測定蛋白濃度。采用10%的SDS-PAGE凝膠電泳，將蛋白轉移至硝酸纖維素膜上，5%脫脂牛奶室溫封閉1 h，用α-SMA(1∶5 000)、PCⅠ(1∶8 000)和β-actin(1∶1 000)一抗孵育，4 ℃搖床過夜，加入辣根過氧化物酶(HRP)標記的二抗(1∶10 000)，常溫孵育1 h，ECL化學發光法顯影，并測定灰度值。

2 結果

2.1 各組大鼠的一般狀況及肝臟、脾臟指數比較 正常組大鼠一般狀況良好、毛色順滑、反應敏銳，無死亡。模型組大鼠精神萎靡、皮毛較為稀少、活動較少，部分出現腹瀉，死亡1只。甲基阿魏酸高、中、低劑量組大鼠精神狀態比模型組有所改善，脫毛現象較少。各組大鼠肝臟、脾臟指數比較見表1。

表1 各組大鼠肝臟、脾臟指數比較

注：與正常組比較，△P<0.01；與模型組比較，*P<0.01。

2.2 各組大鼠病理學變化 正常組大鼠肝臟匯管區及肝小葉架構清晰完整，肝索整齊排列，肝細胞無炎癥壞死。模型組大鼠肝臟匯管區周圍纖維膠原大量增生，肝小葉及肝索正常排列遭到破壞，肝實質細胞大量壞死、出現氣球樣病變。甲基阿魏酸高、中、低劑量組大鼠肝臟纖維化程度有所改善，纖維增生和細胞病變壞死情況減輕。

2.3 甲基阿魏酸對肝功能的影響 各組大鼠血清中ALT、AST水平比較見表2。

表2 各組大鼠血清中ALT、AST水平比較

注：與正常組比較，△P<0.01；與模型組比較，*P<0.01。

2.4 甲基阿魏酸對肝組織脂質過氧化的影響 見表3。

表3 各組肝組織中CAT、GSH-Px、SOD、MDA水平比較

注：與正常組比較，△P<0.01；與模型組比較，*P<0.01。

2.5 甲基阿魏酸對血清肝纖維化標志物的影響 見表4。

表4 各組大鼠血清中PCⅢ、Ⅳ-C、HA、LN水平比較

注：與正常組比較，△P<0.01；與模型組比較，*P<0.01。

2.6 甲基阿魏酸對肝組織α-SMA、PCⅠ mRNA及蛋白表達的影響 見表5。

3 討論

肝纖維化是肝臟受到嚴重損傷時，肝實質細胞出現炎癥壞死，肌成纖維細胞過度增生所致。本實驗采用CCl4皮下注射經典方法復制肝纖維化模型，CCl4進入肝臟后經氧化酶作用形成三氯甲基自由基，其具有細胞毒性，可使細胞膜發生脂質過氧化反應，嚴重損傷細胞。長期多次注射CCl4，可造成肝纖維化，嚴重可致肝硬化[7]。熊美麗等[8]研究發現，甲基阿魏酸可抑制HSC活化和表型轉化，減少ECM堆積。當肝臟受到損傷時，肝細胞膜通透性增強，大量的ALT、AST從細胞內滲出，導致血液中ALT、AST水平急劇上升[9]，故常作為檢測肝功能的靈敏指標。甲基阿魏酸可顯著降低血清中ALT、AST水平，證明其具有保肝作用。CAT、GSH-Px、SOD等抗氧化酶組成了機體抗氧化防御系統[10]。一旦體內的氧化還原平衡被打破，就會引起炎癥、代謝異常及免疫功能降低，發生包膜脂質過氧化反應，大面積細胞損傷可致組織器官纖維化。MDA是細胞膜脂質過氧化反應的終產物，有細胞毒性。本實驗結果顯示，甲基阿魏酸可對抗細胞過氧化損傷，加強機體抗氧化防御功能。

表5 各組大鼠肝組織中α-SMA、PCⅠ mRNA及蛋白表達比較

注：與正常組比較，△P<0.01；與模型組比較，*P<0.01。

PCⅢ、Ⅳ-C、HA和LN為肝纖四項檢查指標，是臨床常用診斷肝病嚴重患者病情發展狀況和治療效果的重要依據。肝纖四項與ECM堆積、膠原交聯成纖維密切相關[11]。本研究結果顯示，甲基阿魏酸高、中、低劑量組中大鼠血清肝纖維化標志物水平普遍明顯降低，表明甲基阿魏酸可降解膠原纖維從而發揮抗肝纖維化作用。

肝纖維化由包括Ⅰ型膠原的諸多ECM蛋白構成的纖維性瘢痕組成[12]。肌成纖維細胞是構成纖維性瘢痕的ECM的來源。肌成纖維細胞表達平滑肌肌動蛋白和Ⅰ型前膠原，僅在受到損傷的肝臟中發現[12],故α-SMA和PCⅠ是檢驗肌成纖維細胞活化的關鍵的蛋白。肝纖維化大鼠給予受試藥物后，α-SMA和PCⅠ表達量明顯降低，表明甲基阿魏酸可抑制α-SMA和PCⅠ表達，從而對抗纖維化發展進程。文獻報道顯示，肝纖維化的發生與機體氧化應激反應有關[13]，目前臨床對肝臟慢性疾病缺乏便捷的診斷方法和有效的治療手段。今后，我們將繼續研究甲基阿魏酸對機體氧化應激的影響。

綜上所述，甲基阿魏酸可有效改善CCl4誘導的肝纖維化大鼠的肝臟氧化損傷，減少ECM的積聚，減輕肝纖維化程度;其機制可能與抑制肝星狀細胞活化及膠原相關因子表達有關。

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Effects of methyl ferulic acid on liver oxidative stress injury and extracellular matrix accumulation in rats with hepatic fibrosis induced by CCl4

LIChen,LIYing,LILi,YANGChengfang,ZHONGYujiuan,WUDan,SHILin,CHENLi,LIYongwen

(GuilinMedicalUniversity,Guilin541004,China)

Objective To study the effects of methyl ferulic acid on liver oxidative stress injury and extracellular matrix accumulation in rats with liver fibrosis induced by carbon tetrachloride (CCl4).Methods Sixty male SD rats were randomly divided into the normal group, model group, high-dose methyl ferulic acid group (20 mg/kg), medium-dose methyl ferulic acid group (10 mg/kg), and low-dose methyl ferulic acid group (5 mg/kg). CCl4was used to replicate the liver fibrosis model, Methyl ferulic acid high-, medium-, and low-dose group were given the appropriate dose of methyl ferulic acid by gavage. Hepatic tissues were stained with HE and the pathological changes were observed. Biochemical analysis was used to detect the levels of alanine aminotransferase (ALT), aspartate aminotransferase (AST), catalase (CAT), glutathione peroxidase (GSH-Px), superoxide dismutase (SOD), and propane aldehyde (MDA). The content of serum precollagen Ⅲ (PCⅢ), type Ⅳ collagen (Ⅳ-C), hyaluronic acid (HA), and laminin (LN) was measured by enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA). The expression of α-SMA, PCI mRNA and protein in liver tissues was detected by reverse transcription-polymerase chain reaction (RT-PCR) and Western blotting.Results Compared with the normal group, the levels of ALT, AST, MDA, PCⅢ, Ⅳ-C, HA, and LN of the model group increased significantly (allP<0.05); the levels of CAT, GSH-Px, and SOD decreased significantly (P<0.05); liver and spleen index significantly increased (P<0.05); significant characteristics of liver fibrosis were found; the mRNA and protein expression of α-SMA and PCI in the liver tissues were significantly enhanced (bothP<0.01). The levels of ALT, AST, MDA, PCⅢ, Ⅳ-C, HA, and LN decreased (allP<0.01), and the activities of CAT, GSH-Px, and SOD increased (allP<0.05), and the liver and spleen index significantly decreased (P<0.05), and the mRNA and protein expression of α-SMA and PCI in the liver tissues decreased in the high-, medium-, and low-dose groups as compared with those of the model group (allP<0.01).Conclusions Methyl ferulic acid can effectively improve the liver oxidative stress injury, reduce the accumulation of extracellular matrix, and alleviate the degree of hepatic fibrosis of rats with hepatic fibrosis induced by CCl4.

liver fibrosis; methyl ferulic acid; carbon tetrachloride; rats

國家自然科學基金資助項目(81360497);廣西高等學校優秀中青年骨干教師培養工程項目。

李辰(1992-)，男，在讀碩士，主要研究方向為抗炎免疫藥理學。E-mail:mailoflch@163.com

李勇文(1969-)，男,博士，教授，主要研究方向為抗炎免疫藥理學。E-mail:liyongwen99@163.com

10.3969/j.issn.1002-266X.2017.25.003

R657.3

A

1002-266X(2017)25-0008-04

2017-04-07)