Piscidinol A對(duì)人肝癌HepG-2細(xì)胞增殖、凋亡的影響

肖雪琴，張敏鴻，劉海，楊建瓊(贛南醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院，江西贛州 34000；贛南醫(yī)學(xué)院)

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Piscidinol A對(duì)人肝癌HepG-2細(xì)胞增殖、凋亡的影響

肖雪琴1，張敏鴻1，劉海2，楊建瓊1
(1贛南醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院，江西贛州 341000；2贛南醫(yī)學(xué)院)

目的 探討匹西狄醇A(Piscidinol A)對(duì)人肝癌HepG-2細(xì)胞增殖及凋亡的影響。方法 取對(duì)數(shù)生長期經(jīng)胰酶消化后的HepG-2細(xì)胞，培養(yǎng)24 h后分為藥物組及對(duì)照組，藥物組加入不同濃度Piscidinol A (6.25、12.5、25、50、100 mg/L)，對(duì)照組加入等體積的含10%胎牛血清RPMI1640培養(yǎng)液，12、24、48 h后采用MTT法檢測(cè)細(xì)胞增殖抑制率，計(jì)算Piscidinol A的半數(shù)抑制濃度(IC50)值；于熒光顯微鏡下通過Hoechst 33258染色觀察凋亡細(xì)胞形態(tài)，采用Annexin Ⅴ-FITC/PI雙標(biāo)記法及流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡率，Western blotting法檢測(cè)B細(xì)胞淋巴瘤/白血病基因伴隨蛋白x(Bax)蛋白表達(dá)。結(jié)果 藥物組Piscidinol A作用后HepG-2細(xì)胞增殖受到抑制且呈量效和時(shí)效關(guān)系，24 h時(shí)IC50值為24.90 mg/L；細(xì)胞凋亡染色顯示，藥物組有典型的細(xì)胞凋亡形態(tài)出現(xiàn)。藥物組6.25、12.5、25、50、100 mg/L的Piscidinol A作用HepG-2細(xì)胞24 h后，細(xì)胞凋亡率分別為11.83%、17.49%、21.72%、34.17%、48.51%，對(duì)照組為7.23%，隨著藥物濃度增大，藥物組細(xì)胞凋亡率相應(yīng)升高，與對(duì)照組相比，P均<0.05。藥物組6.25、12.5、25、50、100 mg/L的Piscidinol A作用HepG-2細(xì)胞24 h后，細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白Bax表達(dá)量分別為0.29、0.33、0.35、0.39、0.43 μg/μL，對(duì)照組為0.24 μg/μL，藥物組隨著Piscidinol A濃度升高，Bax蛋白表達(dá)增加，與對(duì)照組相比，P均<0.05。結(jié)論 Piscidinol A能抑制人肝癌HepG-2細(xì)胞增殖并誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。

肝腫瘤；HepG-2細(xì)胞；匹西狄醇A；細(xì)胞增殖；細(xì)胞凋亡;B細(xì)胞淋巴瘤/白血病基因伴隨蛋白x

匹西狄醇A(Piscidinol A)為從蕓香科植物黃柏中分離得到的三萜類化合物[1，2]，具有廣泛的藥理活性。研究表明，諸多三萜化合物具有化學(xué)預(yù)防、細(xì)胞毒、分化誘導(dǎo)及抗侵襲轉(zhuǎn)移等相關(guān)抗腫瘤活性[3，4]。Piscidinol A為甘遂烷型四環(huán)三萜類化合物，國內(nèi)外有關(guān)Piscidinol A的藥理作用研究表明，Piscidinol A具有免疫抑制作用[5]，可抑制小鼠腹腔巨噬細(xì)胞中NO產(chǎn)生；對(duì)P388白血病細(xì)胞、KB人口腔表皮樣癌細(xì)胞[6]和兩種結(jié)腸癌LoVo、CT-26細(xì)胞[7]具有細(xì)胞毒作用。目前，有關(guān)Piscidinol A的抗腫瘤活性研究較少，除上述細(xì)胞的體外增殖抑制作用外未見其他抗腫瘤作用機(jī)制研究報(bào)道。2015年11月，我們以人肝癌HepG-2細(xì)胞為體外抗腫瘤實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ停接慞iscidinol A對(duì)HepG-2腫瘤細(xì)胞增殖、凋亡的影響并探討其機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料 流式細(xì)胞儀(美國BD公司)；智能型倒置熒光相差顯微鏡(日本Olympus公司)；化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)(美國BIO-RAD公司)；連續(xù)光譜多功能酶標(biāo)儀(美國Thermo Fisher公司)；電子天平(美國丹佛)；CO2培養(yǎng)箱(美國Thermo公司)。Piscidinol A為本課題組從黃柏中提取分離得到，純度為99.5%；胎牛血清和RPMI1640培養(yǎng)基(Gibco公司)；Bax antibody(美國Cell signaling公司)；細(xì)胞凋亡熒光Hoechst 33258檢測(cè)試劑盒(南京凱基生物科技發(fā)展技術(shù)有限公司)；Pierce Goat Anti-Rabbit IgG(H+L)(美國Thermo公司)；Annexin V-FITC Apoptosis Detection kit(美國BD公司)；四甲基偶氮唑藍(lán)(MTT,Sigma公司)；人肝癌HepG-2細(xì)胞(贛南醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院臨床醫(yī)學(xué)研究中心保藏)。

1.2 人肝癌HepG-2細(xì)胞培養(yǎng) 于37 ℃、5%CO2條件下，用RPMI1640培養(yǎng)液(含10%胎牛血清)傳代培養(yǎng)人肝癌HepG-2 細(xì)胞，貼壁細(xì)胞用0.25%胰酶-EDTA消化，實(shí)驗(yàn)用細(xì)胞均處于對(duì)數(shù)生長期。

1.3 Piscidinol A作用后HepG-2細(xì)胞增殖抑制率的測(cè)算 采用MTT法。取對(duì)數(shù)生長期經(jīng)胰酶消化后的HepG-2細(xì)胞，以4×103/孔接種至96孔板培養(yǎng)24 h，分為藥物組及對(duì)照組，藥物組加入含不同濃度藥物(Piscidinol A 6.25、12.5、25、50、100 mg/L，含DMSO體積分?jǐn)?shù)小于0.1%)的培養(yǎng)液200 μL，對(duì)照組加入等體積的含10%胎牛血清RPMI1640培養(yǎng)液，置培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，分別于細(xì)胞培養(yǎng)12、24、48 h后每孔加入5 g/L的MTT溶液20 μL，繼續(xù)孵育4 h，棄上清，加入150 μL的DMSO溶液振蕩至藍(lán)色晶體完全溶解，于酶標(biāo)儀570 nm(參考波長630 nm)處測(cè)定吸光度值(A)，計(jì)算藥物對(duì)細(xì)胞的增殖抑制率。細(xì)胞增殖抑制率(%)=[1-實(shí)驗(yàn)組(A570-A630)/對(duì)照組(A570-A630)]×100%。計(jì)算Piscidinol A的半數(shù)抑制濃度(IC50)值。

1.4 Piscidinol A作用后HepG-2凋亡細(xì)胞形態(tài)觀察 取HepG-2細(xì)胞以1×105/孔接種至6孔培養(yǎng)板，培養(yǎng)24 h后，分為藥物組及對(duì)照組，藥物組加入含不同濃度 Piscidinol A(6.25、12.5、25、50、100 mg/L)培養(yǎng)液2 mL，對(duì)照組加入等體積含10%胎牛血清RPMI1640培養(yǎng)液，置培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h后吸棄上清，用冷Buffer A緩沖液洗滌2次，加入4%甲醛溶液1 mL于4 ℃固定10 min，吸去固定液，用緩沖液洗滌2次，每孔加入Hoechst 33258工作液100 μL，于室溫下染色10 min，用水沖洗后晾干，置熒光顯微鏡下觀察細(xì)胞凋亡形態(tài)。

1.5 Piscidinol A作用后HepG-2細(xì)胞凋亡率測(cè)算 取HepG-2細(xì)胞接種于6孔板中，24 h后藥物組加入含不同濃度Piscidinol A(6.25、12.5、25、50、100 mg/L)培養(yǎng)液2 mL，對(duì)照組加入等量的含10%胎牛血清RPMI1640培養(yǎng)液，藥物作用24 h后收集細(xì)胞，用預(yù)冷PBS洗滌，重懸于Binding buffer溶液并使細(xì)胞濃度為1×106/mL。于100 μL細(xì)胞懸液中分別加入Annexin Ⅴ-FITC及50 μg/mL PI染色液各5 μL，置室溫避光孵育15 min后加入Binding buffer 200 μL，混勻，1 h內(nèi)用流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測(cè)并計(jì)算細(xì)胞凋亡率，凋亡細(xì)胞為Annexin V陽性細(xì)胞。

1.6 Piscidinol A作用后HepG2細(xì)胞中Bax蛋白表達(dá)檢測(cè) 采用Western blotting法。細(xì)胞毒染結(jié)束后，RIPA Buffer裂解液冰上裂解細(xì)胞30 min，離心收集上清，上清中加入上樣緩沖液，沸水浴10 min，冷卻后上樣進(jìn)行SDS-PAGE電泳后濕轉(zhuǎn)；5% BSA 4 ℃搖床封閉30 min，加入一抗，4 ℃搖床孵育過夜，TBST緩沖液洗膜3×10 min；加入對(duì)應(yīng)二抗，室溫?fù)u床孵育1.5 h，TBST緩沖液洗膜3×10 min；PVDF膜上滴加適量化學(xué)發(fā)光試劑，于化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)曝光，攝取圖片后分析實(shí)驗(yàn)結(jié)果。

2 結(jié)果

2.1 Piscidinol A作用后HepG-2 細(xì)胞的增殖抑制率 Piscidinol A對(duì)HepG-2細(xì)胞的增殖抑制率隨藥物濃度升高和時(shí)間延長而增高，呈濃度及時(shí)間依賴性，24 h時(shí)IC50值為24.90 mg/L(圖1)。

圖1 不同時(shí)點(diǎn)Piscidinol A作用后HepG-2細(xì)胞增殖曲線

2.2 Piscidinol A作用后HepG-2凋亡細(xì)胞形態(tài)變化 光鏡下對(duì)照組細(xì)胞呈低強(qiáng)度熒光，胞質(zhì)舒展，細(xì)胞核染色質(zhì)分布均勻；藥物組細(xì)胞生長疏散，細(xì)胞核固縮，染色質(zhì)致密成斑塊狀濃集于核膜下，呈亮藍(lán)色熒光，可見凋亡小體，呈典型凋亡細(xì)胞形態(tài)。

2.3 Piscidinol A作用后HepG-2細(xì)胞凋亡率比較 藥物組6.25、12.5、25、50、100 mg/L的Piscidinol A作用HepG-2細(xì)胞24 h，細(xì)胞凋亡率分別為11.83%、17.49%、21.72%、34.17%、48.51%，對(duì)照組為7.23%，隨藥物濃度增大，藥物組細(xì)胞凋亡率相應(yīng)升高，與對(duì)照組相比,P均<0.05。

2.4 Piscidinol A作用后HepG-2細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白Bax表達(dá)比較 藥物組6.25、12.5、25、50、100 mg/L的Piscidinol A作用HepG-2細(xì)胞24 h，Bax蛋白表達(dá)量分別為0.29、0.33、0.35、0.39、0.43 μg/μL，對(duì)照組為0.24 μg/μL，藥物組隨著藥物濃度升高， Bax蛋白表達(dá)增加，與對(duì)照組相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均<0.05)。

3 討論

Piscidinol A具有較強(qiáng)的藥理活性，文獻(xiàn)[5]報(bào)道Piscidinol A具有免疫抑制作用，可抑制小鼠腹腔巨噬細(xì)胞中NO的產(chǎn)生。日本學(xué)者Itokawa 等[6]發(fā)現(xiàn)Piscidinol A對(duì)P388白血病細(xì)胞和KB人口腔表皮樣癌細(xì)胞有較強(qiáng)的細(xì)胞毒作用；另外，從椿皮中分離得到的Piscidinol A被證實(shí)對(duì)兩種結(jié)腸癌LoVo、CT-26細(xì)胞有一定體外生長抑制作用，且呈劑量依賴性[7]。

本實(shí)驗(yàn)以人肝癌HepG-2細(xì)胞作為體外抗腫瘤實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ停捎肕TT法考察Piscidinol A對(duì)HepG-2細(xì)胞的體外抗腫瘤活性，結(jié)果發(fā)現(xiàn)Piscidinol A能明顯抑制HepG-2腫瘤細(xì)胞生長，呈良好的劑量依賴關(guān)系，作用24 h時(shí)IC50值為24.90 mg/L；通過Hoechst 33258凋亡染色發(fā)現(xiàn)經(jīng)Piscidinol A處理的細(xì)胞呈明顯的形態(tài)學(xué)變化，出現(xiàn)典型的凋亡形態(tài)，提示 Piscidinol A具有促凋亡作用；應(yīng)用流式細(xì)胞術(shù)Annexin Ⅴ-FITC/ PI雙標(biāo)記法定量實(shí)驗(yàn)可見隨著藥物Piscidinol A濃度的增大，細(xì)胞凋亡率逐漸增加，呈劑量依賴關(guān)系，進(jìn)一步表明Piscidinol A能誘導(dǎo)人肝癌HepG-2細(xì)胞凋亡。

細(xì)胞凋亡是致病因子或異常信號(hào)誘導(dǎo)發(fā)生的“生理性”細(xì)胞死亡[8]，其凋亡過程伴隨著細(xì)胞內(nèi)一系列化學(xué)分子信號(hào)的傳導(dǎo)[9，10]，凋亡細(xì)胞通過對(duì)凋亡信號(hào)的感知和一系列的變化及調(diào)控從而釋放一些蛋白，如凋亡介導(dǎo)因子(抗凋亡蛋白Bcl-2、Bcl-x和促凋亡蛋白Bax、Bak)[11]、Caspase家族和核酸內(nèi)切酶、細(xì)胞色素C等[12]，這些釋放物在胞質(zhì)中發(fā)揮作用，介導(dǎo)細(xì)胞凋亡。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，Piscidinol A作用于HepG- 2 細(xì)胞24 h，Bax蛋白表達(dá)較對(duì)照組增高，提示Piscidinol A誘導(dǎo)HepG- 2 細(xì)胞凋亡可能與促凋亡相關(guān)蛋白Bax表達(dá)增加有關(guān)。

綜上所述，Piscidinol A能抑制人肝癌HepG-2細(xì)胞增殖并誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。

[1] 全紹武.黃柏化學(xué)成分和藥理作用的現(xiàn)代研究[J].中外健康文摘，2014(26):185-186.

[2] 孫振剛，邱昆成，李丹，等.UPLC-LTQ-OrbitrapXL分析知母-黃柏藥對(duì)化學(xué)成分[J].中藥材,2017，40(1):101-106.

[3] 李嬌妹，鄭紡，翟麗娟，等.三萜類化合物抗腫瘤活性研究進(jìn)展[J].中草藥，2014，45(15):2265-2271.

[4] 龔如東.具有抗腫瘤活性的三萜類化合物研究進(jìn)展[J].中國民族民間醫(yī)藥,2013，22(5):84-85.

[5] Chen H, Ma SG, Guo ZY, et al. Tirucallane Triterpenoids from the Stems of Brucea mollis [J]. Chem Biodivers, 2013,10(4):695-702.

[6] Itokawa H, Kishi E, Morita H, et al. Cytotoxic Quassinoids and Tirucallane-Type Triterpenes from the Woods of Eurycoma longifolia[J]. Chem Pharm Bull, 1992,40(4),1053-1055.

[7] 錢娟，王瑞平，鄒璽.椿皮的化學(xué)成分及抗腫瘤作用研究進(jìn)展[J].江蘇中醫(yī)藥,2012，44(4):75-77.

[8] 彭黎明，王曾禮.細(xì)胞凋亡的基礎(chǔ)與臨床[M].北京：人民衛(wèi)生出版社,2000：1-35.

[9] 尹智勇，楊俊元，祁宏.Bcl-2 蛋白質(zhì)家族調(diào)控細(xì)胞凋亡機(jī)制的研究進(jìn)展[J].信陽師范學(xué)院學(xué)報(bào),2017,30(2)：340-344.

[10] 郭燕子，符健.腫瘤細(xì)胞凋亡及常用檢測(cè)方法[J].中國熱帶醫(yī)學(xué)，2017，17(4):413-417.

[11] 韓奇鵬，羅玲，揭紅東，等.細(xì)胞凋亡及其調(diào)控因子研究進(jìn)展[J].飼料博覽，2016(4):9-13.

[12] 蘇苗，俞騰飛，郭敏，等.肝細(xì)胞凋亡機(jī)制的研究進(jìn)展[J].中國臨床藥理學(xué)雜志,2015,31(16)：1684-1686.

Effects of piscidinol A on proliferation and apoptosis of human liver cancer HepG-2 cells

XIAOXueqin1,ZHANGMinhong,LIUHai,YANGJianqiong

(1TheFirstAffiliatedHospitalofGannanMedicalUniversity,Ganzhou341000,China)

Objective To investigate the effects of piscidinol A on apoptosis and proliferation of human liver cancer cell line HepG-2 and the mechanism. Methods HepG-2 cells in the logarithmic phase were cultivated for 24h and then were divided into the drug group and the control group after pancreatic enzyme digesting. The drug group was treated by different concentrations of piscidinol A (6.25, 12.5, 25, 50, and 100 mg/L) and the control group was treated by the same volume RPMI1640 culture which was contained 10% fetal bovine serum. MTT assay was applied to detect the proliferation inhibitory rate at 12, 24, and 48 h. IC50of piscidinol A was calculated, and the morphology of apoptotic cells was observed with Hoechst 33258 fluorescence staining. Flow cytometry was applied to detect apoptosis rate of HepG-2 cell by using Annexin Ⅴ-FITC/PI double staining. Western blotting was used to detect the B-cell lymphoma/leukemia-2 associated x (Bax) expression in cells. Results In the drug group, piscidinol A had remarkable proliferation inhibition effect on HepG-2 cells in a dose and time-dependent manner, its IC50was 24.90 mg/L at 24 h. Most of cells presented the typical morphological changes of apoptosis under the fluorescent microscope and more effect occurred with the increasing concentration. After the cells were treated by different concentrations of piscidinol A (6.25, 12.5, 25, 50, 100 mg/L) for 24 h, the apoptosis rates were 11.83%, 17.49%, 21.72%, 34.17%, and 48.51%, respectively in the drug group, versus 7.23% in the control group (allP<0.05); the apoptotic protein expression of Bax was 0.29, 0.33, 0.35, 0.39, and 0.43 μg/μL, respectively in the drug group, versus 0.24 μg/μL in the control group. The apoptosis rate and Bax protein expression increased with the increasing concentrations of piscidinol A in the drug group, and the difference was statistically significant as compared with that of the control group (allP<0.05). Conclusion Piscidinol A inhibits the proliferation and induces apoptosis of human liver cancer HepG-2 cells.

hepatoma; HepG-2 cells; piscidinol A; cells proliferation; apoptosis; B-cell lymphoma/leukemia-2 associated x

江西省衛(wèi)生廳中醫(yī)藥科研基金項(xiàng)目(2014A114)；贛州市指導(dǎo)性科技計(jì)劃項(xiàng)目(GZ2014ZSF125)；江西省教育廳青年科學(xué)基金項(xiàng)目(GJJ150939)；江西省科技廳自然科學(xué)基金計(jì)劃項(xiàng)目(2015ZBAB205005，20161BAB215220)。

肖雪琴(1977-)，女，研究生，副主任醫(yī)師，主要研究方向?yàn)閮和[瘤的診治。E-mail：xiaoxueqin_2004@126.com

劉海(1983-)，男，研究生，副教授，主要研究方向?yàn)樘烊凰幬锘钚猿煞旨捌渲苿┑难芯俊-mail：liuhaiuser@163.com

10.3969/j.issn.1002-266X.2017.25.002

R735.7

A

1002-266X(2017)25-0005-03

2016-11-24)