人腦膠質瘤組織中Gab2、IgG、Integrinβ6的表達變化及其意義

張緒美，徐政秀，張燕，陳敏，李曉蕾，王丹

(1濰坊醫學院附屬醫院，山東濰坊261041；2日照市五蓮縣中醫醫院)

?

人腦膠質瘤組織中Gab2、IgG、Integrinβ6的表達變化及其意義

張緒美1，徐政秀2，張燕1，陳敏1，李曉蕾1，王丹1

(1濰坊醫學院附屬醫院，山東濰坊261041；2日照市五蓮縣中醫醫院)

目的 觀察人腦膠質瘤組織中Gab2、IgG、Integrinβ6的表達變化，并探討其意義。方法 采用免疫組化SP二步法檢測55例份腦膠質瘤組織和20例份正常腦組織中的Gab2、IgG、Integrinβ6。分析腦膠質瘤組織中Gab2、IgG、Integrinβ6表達的相關性，及Gab2、IgG、Integrinβ6表達與腦膠質瘤患者臨床病理參數的關系。結果 腦膠質瘤組織中IgG、Gab2、Integrinβ6表達陽性分別為38(69.0%)、29(52.7%)、45(81.8%)例，正常腦組織中IgG、Gab2、Integrinβ6表達陽性分別為1(5.0%)、1(5.0%)、0例，腦膠質瘤組織中Gab2、IgG、Integrinβ6陽性表達率均高于正常腦組織(P均<0.05)。腦膠質瘤組織中IgG與Gab2表達呈正相關(r=0.312 4，P<0.05﹚，IgG與Integrinβ6表達呈正相關(r=0.398 8，P<0.05﹚。腦膠質瘤未完整切除者Gab2、IgG、Integrinβ6陽性表達比例高于腫瘤完整切除者，腫瘤直徑>5 cm者Gab2、IgG、Integrinβ6陽性表達比例高于直徑≤5 cm者，腫瘤分級Ⅲ～Ⅳ級者Gab2、IgG、Integrinβ6陽性表達比例高于Ⅰ～Ⅱ級者(P均<0.05)。結論 人腦膠質瘤組織中IgG、Gab2、Integrinβ6呈高表達，并與腫瘤直徑、腫瘤完整切除情況和腫瘤分級有關。IgG、Gab2、Integrinβ6可能協同參與了腦膠質瘤的發生發展。

腦膠質瘤；Gab2蛋白；免疫球蛋白G；整合素β6

腦膠質瘤起源于腦部神經膠質細胞，是最常見的顱內腫瘤，約占所有顱內腫瘤的45%，預后差。隨著研究的深入，支架蛋白在腫瘤發生、發展過程中的作用漸漸引起學界關注。支架蛋白在膠質瘤發生發展中的作用成為研究的熱點。Gabs家族蛋白是一類支架蛋白，是細胞信號系統的集合平臺[1]。Gabs蛋白包括Gab1～4多個家族成員，其中Gab2調控細胞生長增殖、分化、凋亡、侵襲等生命過程，具有潛在的原癌基因特性，在人卵巢癌、肺癌、乳腺癌組織中高表達，并與腫瘤的侵襲轉移相關[2～4]。免疫球蛋白G(IgG)是免疫球蛋白的一種，腫瘤源性IgG能夠促進腫瘤細胞的生長[5]。整合素表達于惡性上皮性腫瘤組織[6]，與腫瘤的發生、發展和轉移有著非常密切的關系。Integrinβ6是整合素家族分子之一。本研究觀察了人腦膠質瘤組織中Gab2、IgG、Integrinβ6的表達變化，并探討其臨床意義。

1 材料與方法

1.1 標本來源 選取濰坊醫學院附屬醫院、濰坊市人民醫院2011年1月～2013年12月手術切除并經病理證實的腦膠質瘤標本55例份。腦膠質瘤標本來源患者男30例，女25例；年齡11～74歲，中位年齡44歲；按WHO中樞神經系統膠質瘤分類標準，Ⅰ～Ⅱ級(低級別)25例，Ⅲ～Ⅳ級(高級別)30例。所有標本均用甲醛固定，石蠟包埋，做厚4 μm切片。另取20例正常腦組織(腦外傷患者減壓術中取得)作為對照，標本來源患者男14例、女6例，年齡20～64歲(中位年齡46歲)。腦膠質瘤組與對照組患者的年齡、性別資料具有可比性。

1.2 試劑與材料 Gab2多克隆抗體購自Santa Cruz公司。IgG多克隆抗體購自Sigma公司。Integrinβ6抗體由濰坊醫學院李文通博士提供。SP試劑盒、DAB試劑盒、AEC試劑盒均購自福州邁新生物公司，抗體均為工作液。

1.3 Gab2、IgG、Integrinβ6檢測方法 采用免疫組化SP二步法檢測腦膠質瘤組織和正常腦組織中的Gab2、IgG、Integrinβ6。將石蠟標本做5 μm厚切片，常規脫蠟入水，熱抗原修復，免疫組化SP法染色，Gab2、Integrinβ6兩種抗體DAB鏡下控制顯色，IgG抗體AEC鏡下控制顯色。以PBS代替一抗作陰性對照。顯微鏡下隨機觀察10個高倍視野，每個視野計數100個細胞。以細胞質內出現紅色顆粒為IgG陽性，以細胞膜和細胞質出現棕黃色顆粒為Gab2陽性，以細胞質出現棕黃色顆粒為Integrinβ6陽性。根據陽性細胞百分比和染色強度進行結果判定：陽性細胞百分比<5%計0分，5%～<25%計1分，25%～<50%計2分，≥50%計3分；細胞無著色計0分，淺棕黃色(淡紅色)計1分，棕黃色(紅色)計2分，棕褐色(深紅色)計3分；兩項得分相加，0～1分為蛋白表達陰性，≥2分為蛋白表達陽性。

1.4 統計學方法 采用SAS9.1統計軟件進行統計分析。計數資料比較采用χ2檢驗；相關性分析采用Spearman等級相關分析法。P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 腦膠質瘤組織中Gab2、IgG、Integrinβ6表達變化及其相關性 腦膠質瘤組織中IgG、Gab2、Integrinβ6表達陽性分別為38(69.0%)、29(52.7%)、45(81.8%)例，正常腦組織中IgG、Gab2、Integrinβ6表達陽性分別為1(5.0%)、1(5.0%)、0例，腦膠質瘤組織中Gab2、IgG、Integrinβ6陽性表達率均高于正常腦組織(P均<0.05)。腦膠質瘤組織中IgG與Gab2表達呈正相關(r=0.312 4，P<0.05﹚，IgG與Integrinβ6表達呈正相關(r=0.398 8，P<0.05﹚。

2.2 Gab2、IgG、Integrinβ6表達與腦膠質瘤臨床病理參數的關系 腫瘤未完整切除者Gab2、IgG、Integrinβ6陽性表達比例高于腫瘤完整切除者，腫瘤直徑>5 cm者Gab2、IgG、Integrinβ6陽性表達比例高于直徑≤5 cm者，腫瘤分級Ⅲ～Ⅳ級者Gab2、IgG、Integrinβ6陽性表達比例高于Ⅰ～Ⅱ級者(P均<0.05)。詳見表1。

3 討論

彌漫浸潤性生長是腦膠質瘤的顯著特征，手術難以切除或根本無法手術。膠質瘤的浸潤和復發是導致患者死亡的主要原因。因此，研究膠質瘤侵襲轉移的機制，尋找有效的治療靶點是膠質瘤治療中迫切需要解決的問題。

近年來，支架蛋白的結構及功能成為人們關注的熱點。支架蛋白是底物分子，它們能與酪氨酸激酶結合，發揮聯系各種細胞內外信號蛋白之間交互調控的功能，并可以放大信號的傳導，含有多個結構域和錨定位點[1]。作為一類支架蛋白，Gab2是Gabs家族中的重要成員。近年的研究發現，Gab2具有潛在的原癌基因特性，常在人類乳腺癌、卵巢癌、肺癌中高表達，并且其表達與惡性腫瘤的侵襲轉移密切相關[7]。多項研究表明，Gab2調控著腫瘤細胞的生長增殖、侵襲遷移等過程。對肺癌細胞系的研究發現，Gab2可促進人肺癌細胞A549細胞的侵襲能力[8]。但是到目前為止，Gab2在腦膠質瘤中的表達及作用機制罕見報道。

表1 Gab2、IgG、Integrinβ6表達與腦膠質瘤臨床病理參數的關系(例)

孫磊等[9]報道應用小RNA干擾技術降低Gab2表達使膠質瘤細胞系LN-229侵襲轉移能力降低，說明Gab2與膠質瘤細胞的惡性生物學行為有關。另有研究[10]報道，腫瘤抑制因子miRNA-302a可通過抑制Gab2在膠質瘤中的表達，降低神經膠質瘤細胞的增殖、遷移和入侵能力。本研究結果顯示，Gab2在正常腦組織中低表達，而在膠質瘤組織中高表達，并且隨著臨床分級增高、腫瘤直徑增大其表達也增高，與文獻報道一致，說明Gab2的表達與腦膠質瘤的發病、惡性進展有關，Gab2有望作為預測膠質瘤預后的指標，并可能成為一個抗膠質瘤治療的新靶點。IgG是免疫球蛋白的一種。腫瘤細胞分泌的IgG是一種新發現的分子，主要來源于上皮源性腫瘤細胞，與腫瘤細胞分化、轉移、局部侵入和患者的不良預后密切相關。Chen等[11]證實上皮來源的腫瘤細胞分泌的IgG能夠促進腫瘤細胞的生長和生存。在結直腸癌組織中，IgG的表達與腫瘤的惡性程度(包括分化程度、Dukes分期)具有顯著相關性，即結直腸癌分化程度越差、Dukes分期越高，IgG表達量越高[12]。最近，Lv等[13]發現涎腺腺樣囊性癌細胞中IgG表達，并且IgG表達越高，腫瘤細胞之間的黏附性越低，其浸潤侵襲能力越強。本研究中我們觀察到，IgG在正常腦組織中低表達，在腦膠質瘤組織中高表達，且隨著腦膠質瘤惡性度的增加，IgG表達水平逐漸升高，提示IgG異常高表達可促進膠質瘤的發生和惡性增殖[14]。另外，Xu等[15]在前列腺癌的研究中發現，IgG對腫瘤細胞的存活、增殖、遷移和入侵具有增強作用；通過小干擾RNA技術抑制前列腺癌細胞中IgG的表達后，細胞增殖標志物PCNA表達降低，凋亡標志物Caspase-3表達增高，認為IgG是前列腺癌治療的潛在靶點。

整合素家族是細胞表面的黏附分子，常表達于腫瘤細胞表面，通過介導細胞之間及細胞與外界之間的信號傳導而影響腫瘤細胞的生物學行為。趙艷霞等[16]報道整合素家族成員α6可能與膠質母細胞瘤的惡性增殖和侵襲等生物學行為密切相關。近年來，以Integrinβ6為靶點的靶向治療為結腸癌的臨床治療提供了新的方向[17]。研究[18]證實，通過小干擾RNA技術抑制Integrinβ6基因表達后，可顯著抑制結腸癌細胞的生長和增殖。本研究發現，Integrinβ6在正常腦組織中不表達，而在膠質瘤組織中高表達，隨著腦膠質瘤分級升高、腫瘤直徑增大、腫瘤切除難度增大，其表達也升高，這提示Integrinβ6表達與膠質瘤的惡性生物學行為關系密切，檢測Integrinβ6可能對評估膠質瘤患者預后具有一定價值，Integrinβ6也有望成為腦膠質瘤新的治療靶點。

本研究結果還顯示，腦膠質瘤組織中IgG表達與Gab2、Integrinβ6表達均呈正相關，提示三者之間存在一定相互作用，共同參與腦膠質瘤的發生發展，其作用機制有待于進一步探討。對這一現象繼續深入研究，有望為腦膠質瘤的診斷、預后評估及靶向治療提供新的思路。

[1] Nishida K, Hirano T. The role of Gab family scaffolding adapter proteins in the signal transduction of cytokine and growth factor receptors[J]. Cancer Sci, 2003,94(12):1029-1033.

[2] Wang Y, Sheng Q, Spillman MA, et al. Gab2 regulates the migratory behaviors and E-cadherin expression via activation of the PI3K pathway in ovarian cancer cells[J]. Oncogene, 2012,31(20):2512-2520.

[3] Xu XL, Wang X, Chen ZL, et al. Overexpression of Grb2-associated binder 2 in human lung cancer[J]. Int J Biol Sci, 2011,7(5):496-504.

[4] Bocanegra M, Bergamaschi A, Kim YH, et al. Focal amplification and oncogene dependency of GAB2 in breast cancer[J]. Oncogene, 2010,29(5):774-779.

[5] Kyrou IE, Papakostas JC, Ioachim E, et al. Early ischaemic preconditioning of spinal cord enhanced the binding profile of heat shock protein 70 with neurofilaments and promoted its nuclear translocation after thoraco-abdominal aortic occlusion in pigs[J]. Eur J Vasc Endovasc Surg, 2012, 43(4):408-414.

[6] Arihiro K, Kaneko M, Fujii S, et al. Significance of alpha 9 beta 1 and alpha v beta 6 integrin expression in breast carcinoma[J]. Breast Cancer,2000,7(1):19-26.

[7] Bocanegra M, Bergamaschi A, Kim YH, et al. Focal amplification and oncogene dependency of GAB2 in breast cancer[J].Oncogene, 2010,29(5):774-779.

[8] 史立宏,陶蓉,王云甲，等.Gab2對人肺癌細胞A549侵襲能力影響及其機制的探討[J].中華腫瘤防治雜志,2013,20(16):1207-1211.

[9] 孫磊,劉雨清,李小龍,等.Gab2-Akt-ARK5通路在膠質瘤侵襲中的研究[J].中國腫瘤臨床,2014(9):551-554.

[10] Ma J, Yu J, Liu J, et al. MicroRNA-302a targets GAB2 to suppress cell proliferation, migration and invasion of glioma[J]. Oncol Rep, 2017,37(2):1159-1167.

[11] Chen Z, Qiu X, Gu J.Immunoglobulin expression in non-lymphoid lineage and neoplastic cells[J]. Am J Pathol, 2009,174(4):1139-1148.

[12] Niu N, Zhang J, Huang T, et al. IgG expression in human colorectal cancer and its relationship to cancer cell behaviors[J]. PLoS One, 2012,7(11):e47362.

[13] Lv WQ, Peng J, Wang HC, et al. Expression of cancer cell-derived IgG and extra domain a-containing fibronectin in salivary adenoid cystic carcinoma[J]. Arch Oral Biol, 2017,21(81):15-20.

[14] 薛雨健,張杰,汪明玉,等.IgG在人腦膠質瘤中的表達及其與OPN、MMP-2、MMP-9、P16的關系[J].解剖科學進展,2013,19(6):513-515,519.

[15] Xu Y, Chen B, Zheng S, et al. IgG silencing induces apoptosis and suppresses proliferation, migration and invasion in LNCaP prostate cancer cells[J]. Cell Mol Biol Lett, 2016,3(21):27.

[16] 趙艷霞,孫華平,陳勝,等.Integrin α6在人膠質母細胞瘤組織中的表達及其臨床意義[J].腫瘤防治研究,2013(7):656-659.

[17] Liang B, Shahbaz M, Wang Y, et al. Integrinβ6-targeted immunoliposomes mediate tumor-specific drug delivery and enhance therapeutic efficacy in colon carcinoma[J]. Clin Cancer Res, 2015,21(5):1183-1195.

[18] Song L, Fan Z, Jun N, et al. Tumor specific delivery and therapy mediate by integrin β6-target immunoliposomes for β6-siRNA in colon carcinoma[J]. Oncotarget, 2016,7(51):85163-85175.

山東省醫藥衛生科技發展計劃項目(2015ws0054)；濰坊市衛生局科研項目計劃(2014011)；濰坊醫學院附屬醫院青年創新基金(K12QC1002)。

張緒美(E-mail：zhang2005033@126.com)

10.3969/j.issn.1002-266X.2017.27.018

R739.41

B

1002-266X(2017)27-0061-03

2017-03-24)