側腦室注射微量GnIH大鼠的血漿GnRH、FSH水平及下丘腦組織POMC蛋白表達觀察

司麗娜，吳迪，蘇瑋，魏萌，楊旭慶，陳磊，楊松鶴，程露陽，喬躍兵，4

(1承德醫學院，河北承德067000；2承德醫學院附屬醫院；3陸軍總醫院263臨床部；4滄州醫學高等?？茖W校)

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側腦室注射微量GnIH大鼠的血漿GnRH、FSH水平及下丘腦組織POMC蛋白表達觀察

司麗娜1，吳迪2，蘇瑋3，魏萌1，楊旭慶1，陳磊1，楊松鶴1，程露陽1，喬躍兵1，4

(1承德醫學院，河北承德067000；2承德醫學院附屬醫院；3陸軍總醫院263臨床部；4滄州醫學高等?？茖W校)

目的 觀察側腦室微量注射促性腺激素抑制激素(GnIH)后雄性大鼠血漿促性腺激素釋放激素(GnRH)、卵泡刺激素(FSH)水平變化，及下丘腦組織中阿片促黑素細胞皮質素原(POMC)蛋白的表達變化。方法 雄性SD大鼠60只，隨機分為實驗組和對照組各30只。10%水合氯醛腹腔注射麻醉，實驗組于大鼠側腦室一次性注射GnIH 5 μL，于5 min內注射完畢，留針10 min。對照組給予等量生理鹽水。兩組分別于注射后60、120、240 min各取10只大鼠心房取血，采用ELISA法檢測血漿GnRH、FSH；心房取血后斷頭處死大鼠，取下丘腦組織，采用Western blotting法檢測下丘腦組織中的POMC蛋白。結果 實驗組注射后60、120、240 min血漿GnRH、FSH水平均低于對照組(P均<0.05)，實驗組內注射后不同時點差異無統計學意義。實驗組注射后60、120、240 min下丘腦組織中POMC蛋白相對表達量低于對照組，且實驗組注射后240 min下丘腦組織中POMC蛋白相對表達量低于注射后60、120 min(P均<0.05)。結論 側腦室微量注射GnIH后雄性大鼠血漿GnRH、FSH水平降低，下丘腦組織中POMC蛋白表達下調。GnIH對下丘腦-垂體-性腺軸有一定調節作用，其機制可能與抑制POMC神經元功能有關。

促性腺激素抑制激素；促性腺激素釋放激素；卵泡刺激素；阿片促黑素細胞皮質素原；下丘腦-垂體-性腺軸

哺乳動物的生殖功能主要依賴于下丘腦、垂體和性腺通過自分泌和旁分泌方式所分泌的各種激素進行調控，此神經內分泌調節體系即為下丘腦-垂體-性腺軸。下丘腦以脈沖方式合成并分泌促性腺激素釋放激素(GnRH)。GnRH在生殖內分泌的調控中起到核心作用，其可以興奮或抑制下丘腦及其他一些神經元產生效應。很多學者認為下丘腦分泌GnRH是生殖功能調控的惟一途徑，而促性腺激素抑制激素(GnIH)的發現改變了人們對神經內分泌生殖軸的認識。GnIH是一種由日本鵪鶉腦中分離純化的新型神經肽[1]，GnIH可通過其受體G蛋白耦聯受體147(GPR147)作用于垂體和下丘腦的GnRH神經元，抑制促性腺激素釋放和合成[2]，但具體作用機制還沒有明確報道。雖然在GnRH神經元上有GnIH受體表達，但鑒于GnIH的多效性，不排除它可以通過投射到其他神經元而間接影響GnRH分泌。阿片促黑素細胞皮質素原(POMC)是一種很強的抑制食欲因子，在調節攝食能量平衡和生殖方面發揮重要作用。但是POMC神經元是如何調節生殖功能的，是直接還是間接作用于GnRH神經元，說法不一。有研究觀察到POMC神經元與GnIH神經元之間存在突觸聯系，而有學者則否認這種聯系的存在。因此，本研究觀察了側腦室微量注射GnIH后雄性大鼠血漿GnRH、FSH水平變化，及下丘腦組織中POMC蛋白表達變化，以此探討GnIH對HPG軸的影響及其機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物與主要材料 健康成年雄性SD大鼠60只購自北京華阜康生物科技股份有限公司(合格證號11401300016009)，體質量220～250 g，飼養于實驗動物中心，室溫維持25 ℃左右，通風良好，自由攝食、飲水，飼養兩周后用于實驗，隨機分為實驗組和對照組各30只。酶標儀購自美國Thermo公司，大鼠的腦立體定位儀購自日本Narishige公司，大鼠ELISA試劑盒(GnRH、FSH)購自上海酶連生物有限公司，蛋白定量試劑盒購自上海碧云天生物技術有限公司，GnIH購自美國Peprotech公司，POMC與GAPDH均購自Bioworld公司，二抗(山羊抗兔IgG)購自武漢博士德生物工程有限公司。

1.2 GnIH給藥方法 10%水合氯醛腹腔注射麻醉，實驗組于大鼠側腦室一次性注射GnIH 5 μL，于5 min內注射完畢，留針10 min。對照組給予等量生理鹽水。

1.3 血漿GnRH、FSH檢測 在麻醉狀態下，兩組大鼠分別于側腦室注射后60、120、240 min各取10只大鼠開胸，快速自右心房采集靜脈血，4 ℃ 3 000 r/min離心20 min后取其上清液，-80 ℃儲存。采用ELISA法檢測血漿GnRH、FSH。

1.4 下丘腦組織中POMC蛋白檢測 在麻醉狀態下，兩組大鼠分別于側腦室注射后60、120、240 min各取10只大鼠，心房采血后立即斷頭處死，取下丘腦組織，用PBS清洗，稱重。將下丘腦組織放入勻漿器并加入組織裂解液和蛋白酶抑制劑(PMSF)，勻漿，4 ℃ 12 000 r/min離心30 min，取上清液，-80 ℃儲存備用。用蛋白定量試劑盒測定總蛋白含量，調整電泳上樣量。經SDS-PAGE電泳分離的蛋白電轉移至PVDF膜上，以含5%脫脂奶粉的TBST緩沖液室溫封閉2 h，加入一抗[兔抗POMC(1∶500)，兔抗CAPDH(1∶8 000)]4 ℃孵育過夜，洗膜3次后加入二抗[羊抗兔IgG(1∶4 000)]孵育2 h，洗膜3次，化學發光法顯色。掃描圖像后采用Image J軟件分析蛋白條帶的平均灰度值，以目的條帶與內參條帶灰度值之比代表POMC蛋白相對表達量。

2 結果

實驗組注射后60、120、240 min血漿GnRH、FSH水平均低于對照組(P均<0.05)，實驗組內注射后不同時點差異無統計學意義。實驗組注射后60、120、240 min下丘腦組織中POMC蛋白相對表達量低于對照組，且實驗組注射后240 min下丘腦組織中POMC蛋白相對表達量低于注射后60、120 min(P均<0.05)。詳見表1。

3 討論

GnIH及其同系肽(RFRP)分布于哺乳動物[3]、鳥類[4]、兩棲動物[5]和魚類[6]中。哺乳動物的GnIH神經元主要存在于下丘腦的室周核、背內側核、背內側核與下丘腦腹內側核中間的區域[3]。同時，大多數哺乳動物的垂體、間腦、端腦、視頂蓋等組織都能表達GnIH的內源受體GPR147。有研究[7]顯示GPR147在垂體的促黃體激素(LH)、促卵泡素(FSH)細胞中都有表達。哺乳動物的GnRH1神經元上也有GnIH受體的表達[3]，證明GnIH可能通過GnRH1神經元來抑制生殖功能。有學者認為GnIH通過抑制GnRH神經元進而抑制促黃體激素(LH)和促卵泡素(FSH)的合成與釋放[8]。GnIH及其受體可以在垂體水平抑制促性腺激素的合成與釋放[9]。此外，GnIH在性腺中也有表達[10,11]，這表明GnIH不僅能抑制促性腺激素的釋放，還可能通過某種方式調節性腺的發育。GnIH神經纖維可以投射到NPY神經元、POMC神經元、MCH神經元，這些神經元在控制攝食方面發揮著重要作用[12]。因此，GnIH可能通過與這些神經元相互作用，從而調控神經內分泌生殖系統。

表1 藥物注射后不同時點兩組大鼠血漿GnRH、FSH水平及下丘腦組織中POMC蛋白相對表達量比較

注: 與同時點對照組相比，*P<0.05。

POMC神經元廣泛存在于無脊椎動物及所有脊椎動物的下丘腦中，是調節能量穩態的重要神經元[13]。POMC是在垂體、下丘腦弓狀核表達的一種含有267個氨基酸序列的神經肽，是腦內多種激素的前體，具有調節能量平衡和抑制食欲的重要作用[14]。有學者[15]在大鼠胚胎第12天的下丘腦中就發現POMC的表達，證實POMC神經元在下丘腦能量平衡調節過程中發揮重要作用。研究[16]發現GnIH能降低小鼠腦中POMC細胞的電生理功能，而POMC及其受體表達可提高GnRH神經元的活性[17]。由此推測，GnIH通過其受體可作用于GnRH神經元，可通過其神經纖維投射至POMC神經元，還可能通過POMC神經元間接作用于GnRH，進而影響生殖功能。

GnIH是神經內分泌調節的重要參與者，前期研究已證實GnIH受體存在GnRH神經元上，GnIH可直接作用于GnRH神經元發揮對生殖系統的抑制作用。但GnIH的多效性暗示其不只限于這一種作用途徑，它能進一步投射到腦部其他區域，與該區域的神經元相聯系并發揮作用[18]。由此，POMC神經元可能作為GnIH調節GnRH的一個中間神經元，影響GnIH神經元對下丘腦-垂體-性腺軸的調節作用。我們在側腦室微量注射GnIH后，觀察雄性大鼠GnRH、FSH水平變化，結果顯示側腦室微量注射GnIH后60、120、240 min大鼠血漿GnRH、FSH水平均降低，提示GnIH在一定時間內可抑制GnRH和FSH的分泌，此抑制作用在一定時間范圍內呈時間依賴性。GnIH可抑制下丘腦GnRH神經元的分泌作用，進而抑制垂體FSH的分泌，提示GnIH對下丘腦-垂體生殖軸有一定的抑制作用。本研究還發現側腦室微量注射GnIH 60、120、240 min后，實驗組下丘腦組織中POMC蛋白相對表達量呈下降趨勢，且注射240 min后下丘腦組織中POMC蛋白相對表達量低于注射后60、120 min，表明GnIH在一定時間范圍內對大鼠下丘腦POMC分泌具有負反饋調節作用，可抑制POMC的分泌。本實驗提示GnIH可能通過抑制POMC神經元抑制下丘腦GnRH的釋放，進而抑制垂體促性腺素FSH的釋放，從而發揮對下丘腦-垂體生殖軸的調節作用。然而，GnIH神經元對POMC神經元的調節是直接作用還是間接作用，或是綜合作用的結果，還需要進一步研究來證明。本實驗受河北省高校人體解剖學與組織胚胎學重點發展學科建設項目資助、河北省高校病原生物學重點學科項目資助。

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河北省自然科學基金資助項目(H2013406115)；河北省科學技術研究與發展計劃項目(08276101D-20)；河北省高等學校科學研究項目(QN2015121)；河北省衛生廳醫學科學研究項目(20130021)。

喬躍兵(E-mail:qiaoyuebing@126.com)

10.3969/j.issn.1002-266X.2017.27.009

R-332

A

1002-266X(2017)27-0034-03

2017-03-23)