阿維菌素對膠質(zhì)母細(xì)胞瘤U251細(xì)胞增殖、凋亡的影響及其機制探討

羅丹，羅亮，楊志軍，黃佛寶，王燕燕

(1南方醫(yī)科大學(xué)，廣州510000；2陸軍總醫(yī)院附屬八一腦科醫(yī)院)

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·基礎(chǔ)研究·

阿維菌素對膠質(zhì)母細(xì)胞瘤U251細(xì)胞增殖、凋亡的影響及其機制探討

羅丹1，羅亮2，楊志軍1，黃佛寶1，王燕燕2

(1南方醫(yī)科大學(xué)，廣州510000；2陸軍總醫(yī)院附屬八一腦科醫(yī)院)

目的 觀察阿維菌素(AVMs)對膠質(zhì)母細(xì)胞瘤U251細(xì)胞增殖、凋亡的影響，并探討其相關(guān)機制。方法 傳代培養(yǎng)U251細(xì)胞，將細(xì)胞分為藥物實驗組和陰性對照組，藥物實驗組給予不同濃度的AVMs處理，陰性對照組不加AVMs。取藥物實驗組細(xì)胞，分別給予2、4、6、8、10、12 μmol/L的AVMs，采用MTT法測算給藥24、48、72 h后U251細(xì)胞的增殖抑制率。取藥物實驗組細(xì)胞，分別給予4、8 μmol/L的AVMs培養(yǎng)72 h后，測算各組細(xì)胞凋亡率，檢測各組細(xì)胞線粒體膜電位及細(xì)胞中的Caspase-3、Bcl-2、Bax蛋白。結(jié)果 2、4、6、8、10、12 μmol/L的AVMs作用于U251細(xì)胞后，細(xì)胞增殖抑制率逐漸升高，AVMs作用24、48、72 h后U251細(xì)胞增殖抑制率也逐漸升高；AVMs對U251細(xì)胞的增殖抑制作用呈時間、劑量依賴性(P均<0.01)。AVMs作用72 h時對U251細(xì)胞增殖的IC50為5.220 μmol/L。陰性對照組與藥物實驗組4、8 μmol/L亞組的細(xì)胞凋亡率分別為5.2%±0.16%、31.5%±0.43%、52.4%±0.72%，細(xì)胞線粒體膜電位分別為92.4±2.52、85.2±1.32、45.3±0.75，三組細(xì)胞凋亡率和線粒體膜電位相比，P均<0.01。陰性對照組和藥物實驗組4 μmol/L亞組、8 μmol/L亞組細(xì)胞中Caspase-3、Bax蛋白相對表達(dá)量依次升高，Bcl-2蛋白相對表達(dá)量依次降低(P均<0.01)。結(jié)論 AVMs可抑制U251細(xì)胞增殖并促進(jìn)其凋亡，作用機制可能與降低細(xì)胞線粒體膜電位、調(diào)節(jié)凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)有關(guān)。

阿維菌素；膠質(zhì)瘤；腦膠質(zhì)母細(xì)胞瘤；U251細(xì)胞；細(xì)胞增殖；細(xì)胞凋亡；線粒體膜電位

化療是腦膠質(zhì)母細(xì)胞瘤重要的治療手段，但由于腫瘤細(xì)胞有耐藥性，往往導(dǎo)致化療效果不理想。FDA批準(zhǔn)的一線膠質(zhì)母細(xì)胞瘤化療藥物僅有替莫唑胺，療效不甚理想，篩選和研發(fā)新型藥物意義重大。阿維菌素(AVMs)是由阿維鏈霉菌產(chǎn)生的一類大環(huán)內(nèi)酯類抗生素。越來越多的研究發(fā)現(xiàn)AVMs具有抗腫瘤作用[1]，但其抗腫瘤相關(guān)機制目前還不明確。本研究觀察了AVMs對膠質(zhì)母細(xì)胞瘤U251細(xì)胞增殖和凋亡的影響，并探討相關(guān)機制，現(xiàn)報告如下。

1 材料與方法

1.1 實驗細(xì)胞與主要實驗材料 U251細(xì)胞用含10%胎牛血清的高糖DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)，在37 ℃、5% CO2、飽和濕度條件下生長傳代，根據(jù)細(xì)胞生長狀態(tài)每周傳代2～3次。用新鮮完全培養(yǎng)基重懸為單細(xì)胞。按照細(xì)胞量1∶3左右傳代培養(yǎng)或根據(jù)實驗需要技術(shù)鋪板。將細(xì)胞分為藥物實驗組和陰性對照組，藥物試驗組給予不同濃度AVMs處理，陰性對照組不加入AVMs。AVMs，DMEM,0.25%胰蛋白酶，胎牛血清，MTT，Annexin V-FITC/PI細(xì)胞凋亡檢測試劑盒，線粒體膜電位檢測試劑盒，SYBR Premix Ex Taq，SDS-PAGE凝膠配置試劑盒，Goat anti-Rabbit HRP-IgG(H+L) Antibody，Rabbit anti-Bcl-2 Antibody，Rabbit anti-bax Antibody，Rabbit anti-Caspase3 Antibody，微量移液器。

1.2 AVMs對U251細(xì)胞增殖的影響觀察 收集對數(shù)生長期的U251細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞懸液濃度為(3.0～5.0)×104/mL，將細(xì)胞均勻接種于96孔培養(yǎng)板中，每孔加入150 μL，邊緣孔用無菌PBS填充。細(xì)胞在溫箱孵育12 h后，藥物實驗組分別加入含2、4、6、8、10、12 μmol/L AVMs的培養(yǎng)基，每個濃度設(shè)3個平行孔；同時設(shè)只添加培養(yǎng)基的空白對照組。在在5% CO2、37 ℃溫箱中分別孵育24、48、72 h，倒置顯微鏡下觀察。每孔加入預(yù)先稀釋的 0.5 mg/mL的MTT 20 μL，繼續(xù)避光培養(yǎng)4 h。終止培養(yǎng)，取出96孔板，吸去培養(yǎng)液，每孔加入二甲基亞砜150 μL，置搖床上低速振蕩15 min，待結(jié)晶物溶解后，在酶標(biāo)儀上檢測各孔的光密度值(OD值)。以(藥物實驗組OD值-空白對照組OD值)/(陰性對照組OD值-空白對照組OD值)×100%計算不同濃度AVMs作用后細(xì)胞增殖抑制率。

1.3 AVMs對U251細(xì)胞凋亡的影響觀察 取指數(shù)生長期的U251細(xì)胞，調(diào)整密度為(4～5)×105/孔接種于6孔板內(nèi)，置于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中孵育過夜。藥物實驗組分別加入4、8 μmol/L的AVMs，將藥物實驗組和陰性對照組細(xì)胞繼續(xù)培養(yǎng)72 h。用不含EDTA的胰酶消化收集細(xì)胞，預(yù)冷PBS洗滌2次。加入Binding Buffer 500 μL懸浮細(xì)胞。加入Annexin V-FITC 5 μL混勻后，加入PI 5 μL混勻，室溫、避光條件下反應(yīng)15～30 min。用流式細(xì)胞儀檢測凋亡細(xì)胞，計算細(xì)胞凋亡率。

1.4 AVMs作用后U251細(xì)胞線粒體膜電位檢測 取指數(shù)生長期的U251細(xì)胞，調(diào)整密度為(4～5)×105/孔接種于6孔板內(nèi)，置于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中孵育過夜。藥物實驗組分別加入含4、8 μmol/L AVMs的培養(yǎng)液，藥物實驗組和陰性對照組細(xì)胞繼續(xù)培養(yǎng)72 h。用不含EDTA的胰酶消化收集細(xì)胞，預(yù)冷PBS洗滌2次。取(1.0～6.0)×105個細(xì)胞，重懸于0.5 mL的細(xì)胞培養(yǎng)液中，細(xì)胞培養(yǎng)液中可含血清和酚紅。加入JC-1染色工作液0.5 mL，顛倒數(shù)次混勻，37 ℃孵育20 min，孵育期間配制適量的JC-1染色緩沖液，并放置于冰浴。37 ℃孵育結(jié)束后，500 g離心3 min，沉淀細(xì)胞，棄上清。加入JC-1染色緩沖液1 mL重懸細(xì)胞，500 g、4 ℃下離心3 min，沉淀細(xì)胞，棄上清；重復(fù)此步驟1次。再用適量JC-1染色緩沖液重懸后，置于冰上，流式細(xì)胞儀檢測線粒體膜電位。

1.5 AVMs作用后U251細(xì)胞中Caspase3、Bcl-2、Bax蛋白表達(dá)觀察 取對數(shù)期的U251細(xì)胞，接種于細(xì)胞培養(yǎng)皿上，置于細(xì)胞培養(yǎng)箱在37 ℃、5%CO2、飽和濕度條件下培養(yǎng)24 h，藥物實驗組分別加入4、8 μmol/L AVMs。藥物實驗組和陰性對照組細(xì)胞繼續(xù)培養(yǎng)72 h后提取蛋白，采用Western blotting法檢測U251細(xì)胞中的Caspase3、Bcl-2、Bax蛋白。

2 結(jié)果

2.1 AVMs對U251細(xì)胞增殖的影響 2、4、6、8、10、12 μmol/L的AVMs作用于U251細(xì)胞后，細(xì)胞增殖抑制率逐漸升高，AVMs作用24、48、72 h后U251細(xì)胞增殖抑制率也逐漸升高。AVMs對U251細(xì)胞的增殖抑制作用呈時間、劑量依賴性(P均<0.01)。詳見表1。AVMs作用72 h時對U251細(xì)胞增殖的IC50為5.220 μmol/L。

表1 不同濃度AVMs處理后各時點U251細(xì)胞增殖抑制率(%)

2.2 AVMs對U251細(xì)胞凋亡的影響 陰性對照組與藥物實驗組4、8 μmol/L亞組的細(xì)胞凋亡率分別為5.2%±0.16%、31.5%±0.43%、52.4%±0.72%，三組相比，P均<0.01。AVMs作用后U251細(xì)胞凋亡率增加。

2.3 AVMs作用后U251細(xì)胞線粒體膜電位變化 陰性對照組與藥物實驗組4、8 μmol/L亞組細(xì)胞線粒體膜電位分別為2.4±2.52、85.2±1.32、45.3±0.75，三組相比，P均<0.01。AVMs能夠降低U251細(xì)胞的線粒體膜電位。

2.4 AVMs作用后U251細(xì)胞中Caspase-3、Bcl-2、Bax蛋白表達(dá)變化 陰性對照組和藥物實驗組4 μmol/L亞組、8 μmol/L亞組細(xì)胞中Caspase-3、Bax蛋白相對表達(dá)量依次升高，Bcl-2蛋白相對表達(dá)量依次降低(P均<0.01)。詳見表2。

表2 AVMs作用后U251細(xì)胞中Caspase-3、Bcl-2、Bax蛋白表達(dá)變化

3 討論

目前越來越多的研究表明AVMs具有抗腫瘤作用。本課題組在前期預(yù)實驗中發(fā)現(xiàn)AVMs對膠質(zhì)瘤的增殖有明顯抑制作用，且對腫瘤細(xì)胞具有誘導(dǎo)凋亡的作用，但其作用機制尚未明確。本研究以膠質(zhì)瘤U251細(xì)胞為實驗對象，給予不同濃度的AVMs進(jìn)行處理，發(fā)現(xiàn)AVMs可明顯抑制U251細(xì)胞増殖，且呈濃度和時間依賴性。我們采用Annexin V-FITC/PI雙染色法檢測U251細(xì)胞凋亡情況，發(fā)現(xiàn)兩個給藥實驗組較陰性對照組凋亡率均增加，且隨著藥物濃度增高，細(xì)胞凋亡率也增加，這一結(jié)果同AVMs對U251細(xì)胞的增殖抑制作用是一致的，證明AVMs可抑制U251細(xì)胞增殖并促進(jìn)其凋亡。

細(xì)胞凋亡是細(xì)胞一種正常性、生理性、主動性的細(xì)胞“自殺行為”，是機體的一種自我調(diào)節(jié)機制。這種調(diào)節(jié)機制的異常參與多種疾病的發(fā)生發(fā)展，如惡性腫瘤。目前發(fā)現(xiàn)的凋亡途徑主要有5種，即死亡受體凋亡途徑、線粒體凋亡途徑、B粒酶介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡途徑和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激途徑[2]。通常情況下，細(xì)胞凋亡過程受機體內(nèi)嚴(yán)格調(diào)控，以維持整個機體的穩(wěn)定性。但當(dāng)細(xì)胞凋亡調(diào)控失衡時，可引起細(xì)胞過度增殖，導(dǎo)致相關(guān)疾病如胃腸道腫瘤、子宮內(nèi)膜異位癥(EMs)等[3,4]。線粒體凋亡途徑起到了非常關(guān)鍵的作用，越來越多的證據(jù)表明，線粒體是細(xì)胞凋亡的“中樞”，是凋亡的執(zhí)行者。我們用JC-1法檢測線粒體膜電位，以JC-1從紅色熒光到綠色熒光的轉(zhuǎn)變作為細(xì)胞凋亡早期的標(biāo)志。我們用不同濃度的AVMs作用于U251細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)陰性對照組和藥物實驗組的4、8 μmol/L亞組細(xì)胞線粒體膜電位依次降低，各組較對照組紅、綠熒光強度比均增加，且高濃度組更為明顯，提示隨著AVMs濃度增加，凋亡細(xì)胞數(shù)也隨之增加，AVMs可誘導(dǎo)U251細(xì)胞早期凋亡，這可能與AVMs降低U251細(xì)胞線粒體跨膜電位作用有關(guān)。

研究[5]表明，Bcl-2蛋白和Bax蛋白對細(xì)胞凋亡的調(diào)控起著重要作用。Bcl-2是一種抑制細(xì)胞凋亡的蛋白，而Bax是一種促進(jìn)細(xì)胞凋亡的蛋白，兩者作用相互制約。研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)?shù)蛲霭l(fā)生時，Bax蛋白能從胞質(zhì)轉(zhuǎn)移到線粒體并與線粒體膜相結(jié)合，可以使細(xì)胞色素C釋放[6]，并促進(jìn)線粒體促凋亡因子釋放[7,8]，從而引發(fā)細(xì)胞凋亡。而位于線粒體膜上的Bcl-2蛋白能夠通過與Bax競爭結(jié)合，使Bax蛋白形成異源二聚體，抑制其功能，從而抑制細(xì)胞凋亡；同時Bcl-2蛋白還可抑制Caspase家族蛋白的活化和抑制谷胱甘肽(GSH)外泄，降低胞內(nèi)氧化還原電位，從而抑制細(xì)胞凋亡[9]。Caspase-3蛋白是引發(fā)細(xì)胞凋亡的關(guān)鍵蛋白，是細(xì)胞凋亡的最終執(zhí)行者，在細(xì)胞凋亡調(diào)控中處于中心地位[10]。研究表明Bax蛋白可促進(jìn)Caspase-3表達(dá)和活化，而活化的Caspase-3也可以反過來促進(jìn)Bax蛋白的表達(dá)，同時抑制Bcl-2蛋白的表達(dá)；活化的Caspase-3還可引發(fā)線粒體細(xì)胞色素C釋放，而細(xì)胞色素C反過來又激活Caspase-3，從而形成凋亡信號的正反饋[11～14]。我們檢測了各組細(xì)胞中的凋亡相關(guān)蛋白Caspase-3、Bcl-2、Bax，發(fā)現(xiàn)陰性對照組和藥物實驗組4 μmol/L亞組、8 μmol/L亞組細(xì)胞中Caspase-3、Bax蛋白相對表達(dá)量依次升高，Bcl-2蛋白相對表達(dá)量依次降低，說明AVMs可能上調(diào)U251細(xì)胞中Caspase-3、Bax蛋白的表達(dá)水平，同時降低Bcl-2蛋白的表達(dá)水平。

綜上所述，AVMs可抑制U251細(xì)胞增殖并促進(jìn)其凋亡，作用機制可能與降低細(xì)胞線粒體膜電位、調(diào)節(jié)凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)有關(guān)。上述研究結(jié)果為以后AVMs的臨床應(yīng)用提供了理論依據(jù)。但目前對于AVMs是否能夠透過血腦屏障及達(dá)到有效濃度后是否會引起明顯的不良反應(yīng)，還需進(jìn)一步研究。

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國家自然科學(xué)基金資助項目(81271316)。

楊志軍(E-mail: zhijunyangfmmu@163.com)

10.3969/j.issn.1002-266X.2017.27.008

R739.41

A

1002-266X(2017)27-0031-03

2017-01-03)