“探究培養液中酵母菌種群數量的動態變化”實驗疑難點解答

高 芳

(浙江省臺州市第一中學 318000)

“探究培養液中酵母菌種群數量的動態變化”是高中生物學必修教材中的實驗。該實驗利用血細胞計數板進行酵母菌的顯微計數，并建立數學模型解釋種群數量動態變化規律。無論是實驗技術操作、實驗結果分析，還是實驗內容探究等方面都值得開展。但在實際操作過程中，由于教材很多步驟沒有詳細地解釋，無菌操作和血細胞計數板的使用等技術學生未曾接觸。因此，實驗難度較大，開出率較低。本文針對該實驗過程中的一些疑難問題提出解決方法，為該實驗的廣泛開展提供經驗。

1 血細胞計數板能否選用普通蓋玻片

買來的血細胞計數板沒有蓋玻片，能否使用實驗室普通蓋玻片？若使用普通蓋玻片，會因為蓋片太小(18 mm×18 mm)而不能覆蓋全2個計數室，且質量較輕(厚0.13～0.17 mm，約0.14～0.15 g/個)，不能保證計數室的高度恒定。專用血蓋片(22 mm×26 mm)較大的面積足以蓋全2個計數室，較重的質量(厚0.5 mm，約0.55 g/個)能保證計數室的高度為0.1 mm。

2 酵母菌稀釋倍數

酵母菌數量過多時，需要進行稀釋操作。浙科版高中生物學必修三教材中提及10倍稀釋的方法[1]，往往使學生誤解而直接進行10倍稀釋，造成計數室酵母菌數量過少，引起實驗誤差，此時教師應怎樣指導學生進行合理稀釋呢？

教師可以指導學生在計數前進行稀釋的預實驗：先對原液大致計數，根據估算數目選擇合適倍數進行稀釋，實際操作中，最開始的稀釋只需1～2倍即可。那么稀釋至計數多少細胞數為宜呢？教材要求“計數總數不少于300個細胞”，但當“方格內細胞數目多于300個或者數不過來，可以用稀釋的方法”[1]。此處“計數總數不少于300個細胞”，應是針對規格為25格×16格的計數板中5個中方格的計數總數(規格為16格×25格的計數板則指4個中方格)，即要求每個中方格計數不少于60個。而“方格內細胞數目多于300個則要稀釋”，則應是指每個中方格的計數數目。因此，實際操作時，以每個中方格計數 100個左右為宜，數量太多會使計數難度加大，太少會因稀釋過多而產生誤差。

3 血細胞計數板看不清豎線

血細胞計數板在調焦清晰的情況下，即使視野清晰，也會出現只能看到橫線而看不到豎線的情況，此時難以確定計數室的位置，該如何解決？因為血細胞計數板線條無色，所以顯微鏡觀察時，視野光線應調暗一些。碰到上述情況，可以將反光鏡向側面適當地翻轉調試至某個角度，使得光線強度適當降低，就可以清晰地看到血細胞計數板的豎線。

4 血細胞計數板難以清洗干凈

很多人對血細胞計數板的清洗并不在意，在計數完成后，不及時清洗，或簡單清洗晾干后便用于下次計數。而在再次鏡檢時，發現前次計數的酵母菌仍殘留在計數板表面，嚴重干擾再次觀察計數。怎樣才能將血細胞計數板徹底清洗干凈？首先在使用后應立即清洗，防止細胞失水后黏在計數板上。其次，可用擦鏡紙蘸取酒精擦拭，流動水沖洗數次。如果仍然不干凈，需泡酸后用蒸餾水沖洗。血細胞計數板若使用擦鏡紙擦干，會帶來雜質，可用吹風機吹干或讓其自然風干。

5 加樣時先加菌液還是先蓋蓋玻片

加樣到血細胞計數板上時，是先滴加菌液再蓋蓋玻片，還是先蓋蓋玻片再滴加菌液？血細胞計數板表面有凹槽(圖1)，若先加菌液再蓋蓋玻片，血蓋片落下時極易產生氣泡，還可能造成菌液過量，計數室高度超過1 mm，這些都會造成計數誤差。因此，建議加樣時先蓋蓋玻片，在蓋玻片的邊緣滴加適量菌液，利用毛細作用將菌液滲入蓋玻片下，以保證菌液量合適，且避免氣泡的產生。

圖1 血細胞計數板側面觀模式圖

6 每組培養試管選用多支還是一支

酵母菌培養過程中，每組培養所使用的試管，是自始至終只用1支，還是每組多支試管，每天取其中1支計數，不重復使用？通過將這兩種情況設置對照實驗發現，如僅用1支試管，存在重復取樣帶來污染及計數體積變化帶來誤差的問題，若試管不小心破碎，該組實驗則不能繼續進行。因此，建議每組選用多支試管，每天取其中1支計數，不重復使用的實驗設計，可有效避免以上問題。

7 繪制曲線使用單組數據還是全部數據

將不同時間段的酵母菌數繪制成曲線時，是使用單組數據繪制成多條曲線，還是將全班所有數據匯總繪制成1條曲線？利用SPSS軟件將數據擬合成S型曲線可知，僅用單組數據，每條曲線的擬合度都較低，建立數學模型存在較大誤差；把全班所有數據匯總取平均值，曲線擬合度顯著提高，達到數學模型建立的要求。因此，建議將全部數據匯總繪制成一條曲線。

8 實驗計數誤差的來源

當所有操作都按規范進行，但血細胞計數板的不同計數方格間、同一試管樣品的重復測量間、同一處理的不同試管間酵母菌計數仍存在較大誤差，是什么原因導致的呢？學生親身實踐操作后，通過互相探討，普遍認同混勻這個操作對計數誤差起到關鍵作用，且容易忽視。取樣前搖勻、稀釋后搖勻以保證菌液密度均一，加樣前吹打均勻以保證菌液隨機散布計數室，這些都是避免出現計數誤差的操作細節。