口腔腫瘤組織中HPV感染和P16蛋白表達的臨床意義

丁淑琴，解秀梅，張 凱，洪 虓，王 錦，胡建國

(蚌埠醫學院第一附屬醫院檢驗科,蚌埠 233004；*通訊作者,E-mail:59270847@qq.com)

口腔腫瘤組織中HPV感染和P16蛋白表達的臨床意義

丁淑琴*，解秀梅，張 凱，洪 虓，王 錦，胡建國

(蚌埠醫學院第一附屬醫院檢驗科,蚌埠 233004；*通訊作者,E-mail:59270847@qq.com)

目的 檢測口腔腫瘤中HPV感染及P16蛋白表達率,并分析其臨床意義。 方法 收集44例口腔腫瘤的新鮮組織標本,采用PCR法進行HPV DNA檢測,免疫組化法檢測腫瘤組織中P16的表達情況。分析HPV感染與P16的相關性。 結果 44例口腔腫瘤組織中HPV感染率為47.7%(21/44),P16陽性表達率為77.3%(34/44),44例標本中HPV感染與P16表達無關聯(P>0.05)。與P16陰性組相比,P16陽性組男性、非吸煙、非飲酒者所占比例稍高,但沒有統計學差異(P>0.05)。 結論 口腔腫瘤患者與HPV感染密切有關,口腔腫瘤患者P16表達和HPV感染無關聯性,P16本身可能就可作為誘發口腔腫瘤發生的獨立因素。

人乳頭瘤病毒; 口腔腫瘤; P16

人乳頭狀瘤病毒(human papillomavirus, HPV)是某些皮膚和黏膜良惡性腫瘤的發病原因,尤其是宮頸癌發生的最重要原因。最近研究發現,HPV感染與頭頸部腫瘤發病也有關,HPV感染相關的頭頸部腫瘤患者數量不斷增加[1,2]。HPV成為繼煙草、酒精之后引發頭頸部腫瘤發生的又一大因素[1,2],尤其是在口腔腫瘤、無抽煙及喝酒嗜好的病人中起重要作用[3-6],HPV有關的口腔腫瘤發生率呈快速增加趨勢[7]。目前國外研究證實,HPV陽性的口腔腫瘤是一個獨立的亞型,有獨特的分子生物學及臨床病理特點[8],影響口腔腫瘤患者的預后。但如今國內尚缺乏較大宗的臨床資料來指導HPV相關口腔腫瘤的診斷和治療,對口腔腫瘤與HPV感染相關性的病因學探討也不多,其具體致病機制尚不清楚。另外,有研究報道,口腔腫瘤中P16抑癌基因的產物P16蛋白的表達與HPV感染密切相關,并有研究者建議可作為HPV的替代檢測手段[9,10]。皖北地區是口腔腫瘤的多發地區之一,本地區口腔腫瘤中HPV的感染率如何?P16蛋白在口腔腫瘤組織的表達如何?HPV感染和P16蛋白相關性如何?這些都是我們需要回答的問題。

本研究中HPV-DNA檢測采用SPF10[11,12]PCR-凝膠成像法,SPF10(short PCR fragment)PCR方法已經在宮頸鱗癌的研究中被建立及使用,但目前還很少用于口腔腫瘤的研究。SPF10的引物集擴增的是HPV DNA高度保守區L1區的一部分,產物長度為65 bp。本研究通過檢測皖北地區口腔腫瘤中HPV感染及P16蛋白的表達,結合臨床病例特點進行分析,以期為口腔腫瘤的初步診斷提供有用的指標及為臨床治療提供理論依據。

1 材料和方法

1.1 一般資料

收集2014-10～2015-10蚌埠醫學院附屬醫院口腔科初治口腔腫瘤患者的組織44例,年齡26-79歲,平均年齡57歲,均經病理檢查診斷,術前均未化療或放療。同時收集了該醫院口咽部非腫瘤患者組織20例(包括口腔部外傷或鼾癥矯形手術、炎癥、囊腫)用作對照組。

1.2 取材方法

1.3 主要試劑

DNA提取試劑盒購于天根生化科技有限公司,HPV通用引物SPF10由上海生工合成,SPF10引物集的序列見表1,SPF10[6]的引物集擴增的是HPV DNA高度保守區L1區的一部分,產物長度為65 bp,為39種HPV型別核酸序列中6582-6646這段序列。這39種型別為HPV16，6，11，13，18，26，30，31，33-35，39，40，42-45，51-56，58，59，61，62，64，66-70，72-74，MM4，MM7，MM8,囊括了所有黏膜高危型(7種),目前被認為黏膜低危型別中除32型外也都囊括在內,詳細內容參見文獻[8，9]。PCR試劑盒為Thermo fish公司產品,兔抗人P16單克隆抗體購自abcam公司,SP免疫組織化學試劑盒購于福州邁新生物技術開發有限公司。

表 1 SPF10的引物集序列

Table 1 Sequences of SPF10 primers

SPFprimers序列(5′→3′) SPF1AGCiCAGGGiCACAATAATGGSPF1BGCiCAGGGiCATAACAATGGSPF1CGCiCAGGGiCATAATAATGGSPF1DGCiCAAGGiCATAATAATGGSPF2BGTiGTATCiACAACAGTAACAAASPF2DGTiGTATCiACTACAGTAACAAA

i:次黃嘌呤;SPF1:上游引物;SPF2:下游引物

1.4 SPF10 PCR法檢測HPV-DNA

①將冷凍的組織標本勻漿，然后按試劑盒操作說明書進行人基因組DNA的提取。②使用HPV通用引物SPF10進行PCR擴增,擴增片段長度為65 bp。每次PCR反應都設有陰性質控(distilled H2O)和陽性質控(已知HPVHPV陽性標本)。③使用GAPDH作內參,GAPDH引物序列上游:5′-AGAAGGCTGGGGCTCATTTG-3′,下游:5′-AGGGGCCATCCACAGTCTTC′-3′。擴增產物長度為258 bp。④用3%瓊脂糖電泳并成像。⑤結果判斷:在65 bp處有明顯條帶者為HPV陽性。

1.5 免疫組化檢測P16蛋白的表達

使用常規免疫組織化學法檢測口腔腫瘤和口腔部非腫瘤組織中的P16蛋白的表達,P16一抗稀釋度(1 ∶100)，抗原修復采用0.01 mol/L檸檬酸鹽緩沖液高壓蒸汽修復法。用羊血清替代一抗作為陰性對照,用已知陽性切片作為陽性對照。

免疫組化結果判定：P16陽性染色為細胞核和胞質出現棕黃色顆粒。判定標準:采用半定量方法,采用高倍視野隨機記數500個腫瘤細胞,按陽性細胞所占比例,分為4級,≤5%為陰性(-),>5%-25%為輕度陽性(+),>25%-75%為中度陽性(++),>75%以上為強陽性(+++)。由兩位病理科醫生雙盲閱片并判定結果。

1.6 統計學方法

采用SPSS 19.0軟件進行分析,計量資料采用t檢驗,計數資料采用卡方檢驗,P<0.05為差異具有統計學意義。

2 結果

2.1 口腔腫瘤與非腫瘤組織中HPV感染情況及其相關性

采用PCR法檢測口腔腫瘤組織中HPV DNA(見圖1)。選取陽性標本進行DNA測序鑒定(見圖2)，對測序結果進行B1ast比對，結果顯示所獲得的HPV DNA序列與GenBank中人HPV DNA相同(見圖3)。本研究觀察到44例口腔腫瘤患者中21例HPV陽性,陽性率47.7%;20例非腫瘤患者中2例HPV陽性,陽性率僅10.0%(見表2),口腔腫瘤患者可能與HPV感染密切有關(χ2=8.501,P=0.004)。

1-3.HPV陽性標本;4.HPV陰性標本;5.HPV陽性質控;6.陰性質控;M.DNA Marker圖1 HPV DNA擴增產物瓊脂糖電泳成像 Figure 1 Agarose electrophoresis of HPV DNA PCR production

圖2 HPV PCR產物測序的圖譜Figure 2 Sequencing of HPV PCR production

圖3 HPV PCR產物測序結果的序列比對Figure 3 Sequence blast of HPV PCR production

表 2 口腔腫瘤與非腫瘤組織中HPV感染情況和P16蛋白表達情況

Table 2 HPV infection and P16 protein expression in oral neoplasms and non-neoplastic tissue

組織nHPVP16+-χ2P+-χ2P口腔部腫瘤 口腔部非腫瘤44203122318850100043401020329700000

2.2 不同HPV狀態的口腔部腫瘤P16蛋白表達情況及其關聯性

免疫組化檢測P16蛋白在口腔腫瘤組織中表達，在細胞核或胞質出現棕黃色或棕褐色顆粒為陽性表達(見圖4)。44例口腔腫瘤患者中34例P16陽性,陽性率77.3%,而20例非腫瘤患者P16均陰性。通過分析44例口腔標本,發現HPV與P16僅存在弱關聯。21例HPV陽性患者中P16陽性18例(85.71%),但HPV陰性患者中P16陽性率也較高,為69.56%(16/23)(見表3)。提示除HPV外,某些其他因素也可使P16蛋白表達上調或P16本身就可作為誘發口腔腫瘤發生的獨立因素。

A-C為口腔正常組織,D-F為口腔腫瘤組織;A,D.口腔腫瘤組織HE染色(×400);B,C,E,F.P16免疫組化結果(B，E.×100;C，F.×400)圖4 P16在口腔腫瘤組織中的表達Figure 4 P16 protein expression in oral tumor

表 3 HPV陽性和陰性的口腔部腫瘤P16蛋白表達情況(以5%為界)

Table 3 P16 protein expression in HPV-positive and HPV-negative oral tumor

P16HPV?DNA(+)HPV?DNA(-)合計(+)181634(-)3710合計212344

2.3 口腔腫瘤患者HPV感染及P16蛋白表達與臨床特征比較

HPV及P16的陽性組與陰性組相對比,年齡、性別、吸煙、飲酒、發病部位均差異無統計學意義(P>0.05),但HPV及P16的陽性組中男性、非吸煙、非飲酒者比例相對更高,但差異沒有統計學意義(P>0.05,見表4)。

3 討論

HPV是一種DNA病毒,屬乳多空病毒科乳頭狀瘤病毒屬。廣泛存在于自然界中,是一組致瘤性病毒。因越來越多腫瘤被發現與HPV感染有關,使得HPV日益被人們重視及研究。隨著分子生物學技術的發展,對HPV的致病機制有了進一步的認識。游離或整合狀態的HPV-DNA潛入宿主細胞,引起一系列的變化,使細胞增殖和轉化發生異常[13]。雖然HPV已被普遍公認為是一種腫瘤相關病毒,但過去較多的研究都集中在HPV與宮頸癌的關系上。近來,HPV與頭頸部腫瘤的關系受到廣泛的關注,并有一系列的報道闡述了HPV在不同部位的頭頸部腫瘤中的表達,檢出率為20%-100%不等[14]。本次研究表明HPV感染在口腔腫瘤中的感染率為47.7%,由于本次研究重點是探究HPV總感染率,未進行分型,僅隨機抽取了3個HPV陽性標本的PCR擴增產物進行測序并比對,結果均為HPV16型,與報道的HPV16型是HPV陽性口腔腫瘤的最常見型別相符[15,16]。國外的大量臨床試驗結果均表明:與HPV陰性相比,HPV陽性口腔腫瘤患者腫瘤進展的風險較低,對放化療治療更加敏感,且預后明顯好于HPV陰性口腔腫瘤患者[17,18]。因此,對于HPV陽性口腔腫瘤患者可考慮降低局部治療的強度,包括降低放療劑量、單純放療代替放化療或用靶向治療替代化療。希望在不久的將來,我們能夠根據HPV感染狀態來判斷口腔腫瘤患者的預后并指導治療決策,為HPV陽性口腔腫瘤患者制定個體化的治療方案以改善預后,降低治療相關毒性,提高患者的生活質量。

表 4 口腔腫瘤患者HPV感染及P16蛋白表達與臨床特征比較

Table 4 Correlation of HPV infection, P16 protein expression and other parameters in oral neoplasms

臨床特征HPV感染+-卡方值PP16表達+-P年齡082003650817a ≤60歲1210175 >60歲913175性別086303530654a 男1413234 女710116吸煙019506590172a 是6886 否1515264飲酒003008620754a 是5683 否1617267部位0．13205610442a 牙齦610124 舌6693 頰3461 頜6372

a期望計數小于5,用Monte Carlo法計算

P16基因又叫MTS(multiple tumor suppressor 1)基因,是一種多腫瘤的抑制基因。到目前為止,已經在人類的許多惡性腫瘤及頭頸部腫瘤中檢測到P16基因的改變[19],引起許多學者在多領域的廣泛研究。有研究表明P16基因在口腔頜面部多種惡性腫瘤中表現異常[20]。最近有學者報道,在口腔腫瘤患者中P16蛋白的表達與HPV感染密切相關,并認為可以將較廉價且操作相對簡單的P16免疫組化作為HPV感染檢測的替代檢測手段[9,10];而有些學者則報道在口腔腫瘤中沒有發現P16表達與HPV感染的相關性,不主張將P16表達狀態作為HPV感染強有力的替代檢測指標[21-23]。本研究中雖然21例HPV陽性口腔腫瘤中有18例P16蛋白陽性,但P16蛋白在23例HPV陰性口腔腫瘤中也有16例陽性,P16在HPV陽性與HPV陰性口腔腫瘤中的表達沒有統計學上的差異(P>0.05)。本研究結果與Harris等[24]的研究結果一致,Harris等研究表明,其所觀察的年輕舌癌患者中,在HPV低感染的前提下,仍有P16的高表達,提示P16可以作為誘發年輕舌癌患者的獨立因素[24]。本研究中,P16蛋白陽性的口腔腫瘤中只有52.94% HPV陽性(18/34),故推測P16本身就可作為誘發口腔腫瘤發生的獨立因素。國外一些研究顯示,P16蛋白高表達的口腔腫瘤患者有更好的治療效果和預后[26]。希望隨著研究的深入,P16基因能為口腔腫瘤乃至其他腫瘤的預防、診斷和治療提供新的思路。

本課題組分析了HPV和P16與口腔腫瘤患者煙酒嗜好乃至性別等的關系,結果表明,與HPV陰性組相比,HPV陽性組男性、非抽煙、非嗜酒者所占比例較高,但差異沒有統計學意義(P>0.05);與P16蛋白陰性組相比,P16陽性組男性、非抽煙、非嗜酒者所占比例也較高,差異也沒有統計學意義(P>0.05)。

綜上所述,本研究表明:HPV是口腔腫瘤發生的重要致瘤因素;P16也可能是誘發口腔腫瘤發生的獨立因素。但因本研究樣本例數有限,結果尚帶有偶然性,仍需擴大樣本量進一步研究。

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Clinical value of HPV infection and P16 protein expression in oral neoplasms

DING Shuqin*,XIE Xiumei,ZHANG Kai,HONG Xiao,WANG Jin,HU Jianguo

(DepartmentofClinicalLaboratory,FirstAffiliatedHospitalofBengbuMedicalCollege,Bengbu233004,China;*Correspondingauthor,E-mail:59270847@qq.com)

ObjectiveTo investigate the infection rate of human papillomavirus(HPV) and P16 protein expression in oral neoplasm tissues and their clinical value.MethodsHPV DNA was detected by PCR and P16 protein was determined in 44 cases of oral tumor tissue by immunohistochemistry. The correlation of HPV infection with P16 protein expression was assessed.ResultsThe incidence of HPV infection in oral tumor was 47.7%(21/44).The P16 was expressed in 77.3%(34/44) of the tumor tissues.The P16 protein expression was not correlated with the presence of HPV infection in 44 specimens(P>0.05). The proportions of male non-smokers and non-drinkers were higher in P16-positive group than in P16-negative group, respectively, but the difference was not statistically significance(P>0.05).ConclusionOral cancer is highly correlated with the infection of HPV, and P16 could be an independent risk factor for oral cancer.

oral neoplasms; HPV; P16 protein

安徽省高等學校自然科學研究一般項目(KJ2015B081by,KJ2015B052by);蚌埠醫學院創新課題項目(Byycxz1508)

丁淑琴,女,1980-11生,碩士,主管技師,講師,E-mail:59270847@qq.com

2017-02-28

R739.85

A

1007-6611(2017)07-0724-06

10.13753/j.issn.1007-6611.2017.07.019