肌萎縮性側索硬化患者腦脊液和血清IL-6、IL-15的臨床分析

鄭 勇,臧大維

(天津市第一中心醫院神經內科,天津 300192;*通訊作者,E-mail:dwzang656@163.com)

肌萎縮性側索硬化患者腦脊液和血清IL-6、IL-15的臨床分析

鄭 勇,臧大維*

(天津市第一中心醫院神經內科,天津 300192;*通訊作者,E-mail:dwzang656@163.com)

目的 檢測肌萎縮性側索硬化(amyotrophic lateral sclerosis,ALS)患者腦脊液(CSF)和血清中白細胞介素-6(IL-6)、白細胞介素-15(IL-15)的水平變化,并分析其與臨床參數的相關性。 方法 通過ELISA酶聯免疫吸附法分別檢測42例ALS患者和62例非炎癥性神經疾病(non-inflammatory neurological disease,NIND)對照組患者腦脊液和血清標本中IL-6、IL-15水平。統計患者的病程、ALS功能評分量表(ALSFRS-r)評分并計算疾病進展率(DPR)。分析IL-6及IL-15與各種臨床參數的相關性。 結果 ALS患者腦脊液中IL-6和IL-15的水平相對于ALS患者血清中的IL-6和IL-15水平顯著增加(P<0.05), 與DPR呈正相關(P<0.01),與病程時間呈負相關(P<0.01)。ALS患者CSF中的IL-6和IL-15與患者生存率相關(P<0.05)。 結論 ALS患者腦脊液中的IL-6和IL-15水平比血清中的更高,其臨床測量有益于ALS的疾病分化和進展評估,對疾病診斷和進展具有潛在的臨床意義。

肌萎縮性側索硬化; 白細胞介素; 疾病進展率; ALSFRS-r

肌萎縮性側索硬化(amyotrophic lateral sclerosis,ALS)是一種致命的神經變性疾病,其影響腦和脊髓中的運動神經元,導致麻痹并最終死亡[1]。目前已經發表了多種ALS生物標志物相關的研究結果[2],這些研究注重于CSF或血清中生物標志物的鑒定,大多數研究中的生物標志物的變化可以區分ALS患者與健康對照受試者,但一些研究結果受到分析中樣本數量的限制和不同對照組的影響[3,4]。此外,在最近的一些研究中,在CSF或血清中所檢測生物標志物研究的重點更側重于疾病的診斷而不是臨床預后等相關的研究[5,6]。既往研究[7]觀察到ALS患者腦脊液和血清中白細胞介素IL-10、IL-12及粒細胞-巨噬細胞集落刺激因子(GM-CSF)等的升高,但目前幾乎沒有關于腦脊液中IL-6、IL-15水平如何影響ALS患者(特別是中國的ALS患者)疾病進展的相關研究。我們通過對大量ALS患者血清及腦脊液中的IL-6、IL-15水平進行測量,以觀察這些白細胞介素水平對ALS的影響,并分析IL-6、IL-15是否可以作為ALS患者疾病分化和進展評價的指標。

1 材料與方法

1.1 研究對象

本研究經天津市第一中心醫院人體臨床試驗委員會批準(2009SN-K041和2015SN-K001)。參與本研究的患者選自2010-01～2015-05期間在天津市第一中心醫院神經內科病房住院的ALS患者與非炎癥性神經系統疾病(NIND)患者,所有參加研究的患者均已簽署書面知情同意書,所有ALS患者符合修訂的EI Escorial臨床確診標準;非炎癥性神經系統疾病(NIND)對照組患者包括:緊張型頭痛(n=23)、低鉀血癥(n=9)、低顱內壓(n=18)、腦脊液漏出(n=12)。在早晨8時至中午12時之間,通過腰椎穿刺獲得腦脊髓液(CSF)樣品,并通過靜脈穿刺獲得外周全血樣品。在腰椎穿刺之前對每個ALS患者進行修訂ALS功能評定量表(ALSFRS-r)評分及疾病進展速率(DPR)的計算。DPR計算公式為:DPR=(48-ALSFRS-r)/病程(月)。通過對ALS患者電話訪問或門診復診跟蹤患者的生存狀況。ALS和NIND患者的情況見表1。

表 1 ALS和非炎癥性神經系統疾病患者一般資料

Table 1 Clinical characteristics of the ALS and NINDC patients

組別男/女年齡(歲)臨床診斷(確診/可能)臨床發病(B/L)疾病進展率(DPR，%)ALSFRS?r病程時間(月)ALS組22/205215±31822/2018/24161±0153349±0651469±188NIND組32/305332±311N/AN/AN/AN/AN/A

B:延髓癥狀起病;L:四肢癥狀起病;ALSFRS-r:肌萎縮性側索硬化功能評定量表;N/A:不適用

1.2 儀器與試劑

人白細胞介素ELISA試劑盒(R&D Systems,USA);BioTek Synergy 2酶標儀(BioTek,USA)。

1.3 方法

1.3.1 血清和CSF標本收集 從所有患者(42例ALS患者和62例NIND患者)抽取血液標本,并在2 h內在4 ℃以3 000 r/min離心10 min,將上清液保存在-80 ℃冰箱直至實驗開始;從取得血液標本到標本離心的平均時間為(68.28±7.96)min。同時通過腰椎穿刺獲取42例ALS患者和62例NIND患者的CSF標本,并立即在4 ℃以800 r/min離心5 min,將上清液儲存在-80 ℃冰箱直到實驗開始;從腰椎穿刺獲取腦脊液標本到標本離心的平均時間為(18.29±5.52)min。

1.3.2 IL-6、IL-15的ELISA檢測 使用ELISA試劑盒(R&D Systems,USA)并按照說明書要求測定IL-6、IL-15在腦脊液及血清中的水平。

1.4 統計學方法

2 結果

2.1 ALS和NIND患者年齡分析

ALS和NIND患者之間在年齡方面沒有統計學差異(見表1)。

2.2 ALS和NIND患者腦脊液和血清中的IL-6、IL-15水平分析

與NIND患者相比,ALS患者的腦脊液IL-6、IL-15顯著增加,但在血清中沒有統計學差異(見表2)。

表 2 ALS和NIND患者腦脊液和血清中的IL-6、IL-15水平比較 (ng/ml)

Table 2 IL-6, IL-15 levels in cerebrospinal fluid and serum of ALS and NINDC patients (ng/ml)

指標標本ALS組NIND組IL?6腦脊液20811±211?15625±600血清 12856±53212028±479IL?15腦脊液44159±1223?40320±159血清 28253±116227975±1216

與NIND組的比較,*P<0.05

2.3 兩種因子與DPR、病程時間和ALSFRS-r的關聯

ALS患者的腦脊液中的IL-6與DPR呈正相關,與病程時間負相關,與ALSFRS-r不相關;IL-15與DPR呈正相關,與病程時間負相關,與ALSFRS-r不相關(見表3)。

表 3 ALS患者腦脊液中IL-6,IL-15與DPR、病程時間和ALSFRS-r評分水平的相關分析

Table 3 Correlation of the levels of IL-6,IL-15 in cerebrolpinal fluicl with DPRs, durations, and ALSFRS-r scores

指標疾病進展率(DPR)病程時間ALSFRS?rrPrPrPIL?60391600010-0319300153-0185301881IL?1505872<00001-04981<00001-0133803712

2.4 ALS患者的存活與IL-6，IL-15的水平之間的關聯

入選本研究的42例ALS患者跟蹤隨訪至就診后54個月，IL-6生存率中值為41.22,依照中值將IL-6分為高于中值組及低于中值組,IL-15生存率中值為46.96,依照中值將IL-15分為高于中值組及低于中值組。與低于中值的IL-6和IL-15組相比,高于中值的IL-6和IL-15組的壽命顯著降低(見圖1)。

IL-6-H、IL-15-H:具有高于中值的IL-6、IL-15水平的ALS患者;IL-6-L、IL-15-L:具有低于中值IL-6、IL-15水平的ALS患者圖1 ALS患者的生存分析Figure 1 Survival analyses of ALS patients

3 討論

IL-6是Hirano等首次描述的B細胞分化因子,通常由T細胞衍生,但也可由其他細胞產生,包括CNS中的星形膠質細胞和小膠質細胞[8,9]。在單純皰疹病毒腦炎和其他細菌和病毒引起的CNS感染中,腦脊液中的IL-6水平也普遍升高;相反,在非感染性CNS炎性疾病中結果具有多變性,在系統性紅斑狼瘡中檢測到IL-6,但在多發性硬化(MS)中未檢測到IL-6[10]。IL-6可誘導神經元分化并在神經元分化中發揮神經營養調節作用。此外,IL-6在腦損傷時明顯增加。IL-6可能由ALS中的星形膠質細胞或小膠質細胞產生,作為運動神經元或其他CNS細胞變性的非特異性應答反應[11,12]。我們研究發現,ALS患者腦脊液中IL-6水平比對照組患者腦脊液中IL-6水平明顯增高,并發現ALS患者腦脊液中IL-6水平與DPR或病程時間之間有顯著關聯。在腦組織中,具有更高水平的IL-6,因此,在ALS患者發病狀態下,其腦脊液中的IL-6的變化應更具有特異性,而ALS患者血清中的IL-6水平變化并不明顯。

IL-15是促炎細胞因子,它由活化的血液單核細胞、巨噬細胞、樹突狀細胞和活化的神經膠質細胞產生,促進T細胞增殖、誘導細胞溶解效應,包括天然殺傷細胞和細胞毒性細胞,在某些神經疾病如多發性硬化和癡呆癥中IL-15刺激B細胞增殖和分泌免疫球蛋白[13，14]。本研究結果顯示，ALS患者腦脊液中的IL-15水平與對照組患者的腦脊液中的IL-15水平顯著不同,與DPR正相關,并與病程時間負相關。這可能與IL-15參與ALS中樞神經系統炎癥活性有關[15]。相反,與西方關于ALS患者的研究[16]不同,在我們研究中發現ALS患者和對照之間的血清IL-15水平沒有差異,這可能與種族或患者選擇的差異有關,而且血清中IL-15的水平容易受許多其他因素和疾病的影響,這可能導致不可預測的變化。

本研究我們主要集中檢測ALS患者腦脊液和血清中的IL-6、IL-15的變化。與對照組相比,ALS患者的腦脊液中的IL-6、IL-15水平顯著增加。ALS患者腦脊液中的IL-6和IL-15水平比血清中的IL-6和IL-15水平更具有特異性,并且與疾病進展密切相關。具有較低IL-6，IL-15水平的ALS患者比具有較高IL-6，IL-15水平的ALS患者存活時間更長。

鑒于上述關于ALS患者腦脊液和血清中IL-6、IL-15水平的研究發現,可以合理地假設,腦脊液中IL-6和IL-15水平的變化比血清中的變化更可靠。已有證據表明免疫因素可能參與ALS的致病機制[16],本研究觀察到所有兩種白細胞介素在腦脊液或血清中都增加,這些白細胞介素可能是參與ALS致病機制中作為免疫激活的潛在標志物。

總之,本研究發現,檢測腦脊液中IL-6和IL-15的水平對ALS患者疾病鑒別診斷和進展有一定的臨床潛在價值。由于腦脊液中這些白細胞介素的水平與血清中的不同,因此腦脊液中這些白細胞介素的測量在疾病的診斷和評估疾病進展方面比血清測量更可靠。本研究無法確定腦脊液中IL-6和IL-15水平的變化是否與疾病發生或結果相關。

[1] Frakes AE, Braun L, Ferraiuolo L,etal. Additive amelioration of ALS by co-targeting independent pathogenic mechanisms[J]. Ann Clin Transl Neurol, 2017, 4(2):76-86.

[2] Gagliano SA, Pouget JG, Hardy J,etal. Genomics implicates adaptive and innate immunity in Alzheimer's and Parkinson's diseases[J]. Ann Clin Transl Neurol, 2016, 3(12):924-933.

[3] Qi Y, Yin X, Wang S,etal. Differential peroxisome proliferator activated receptors activity in a rodent model of amyotrophic lateral sclerosis[J]. Int J Clin Exp Med, 2015, 8(3):3743-3751.

[4] Gray E, Larkin JR, Claridge TD,etal. The longitudinal cerebrospinal fluid metabolomic profile of amyotrophic lateral sclerosis [J]. Amyotroph Lat Scl Fr,2015,16(7-8):456-463.

[5] Kuhle J, Lindberg RL, Regeniter A,etal. Increased levels of inflammatory chemokines in amyotrophic lateral sclerosis [J].Eur J Neurol, 2009,16(6):771-774.

[6] Chen X, Guo X, Huang R,etal. An exploratory study of serum creatinine levels in patients with amyotrophic lateral sclerosis [J]. Neurol Sci, 2014,35(10):1591-1597.

[7] Frakes AE, Braun L, Ferraiuolo L,etal. Additive amelioration of ALS by co-targeting independent pathogenic mechanisms[J]. Ann Clin Transl Neurol, 2017, 4(2):76-86.

[8] Patin F, Baranek T, Vourc'h P,etal. Combined metabolomics and transcriptomics approaches to assess the IL-6 blockade as a therapeutic of ALS: Deleterious alteration of lipid metabolism[J]. Neurotherapeutics, 2016, 13(4):905-917.

[9] Mizwicki MT, Fiala M, Magpantay L,etal. Tocilizumab attenuates inflammation in ALS patients through inhibition of IL6 receptor signaling[J]. Am J Neurodegener Dis, 2012, 1(3):305-315.

[10] Ringer C, Tune S, Bertoune MA,etal. Disruption of calcitonin gene-related peptide signaling accelerates muscle denervation and dampens cytotoxic neuroinflammation in SOD1 mutant mice[J]. Cell Mol Life Sci, 2017, 74(2):339-358.

[11] Furukawa T, Matsui N, Fujita K,etal. Increased proinflammatory cytokines in sera of patients with multifocal motor neuropathy[J]. J Neurol Sci, 2014, 346(1-2):75-79.

[12] T?nges L, Günther R, Suhr M,etal. Rho kinase inhibition modulates microglia activation and improves survival in a model of amyotrophic lateral sclerosis[J]. Glia, 2014,62(2):217-232.

[13] Choi MR, Kim HY, Park JY,etal. Selection of optimal passage of bone marrow-derived mesenchymal stem cells for stem cell therapy in patients with amyotrophic lateral sclerosis[J]. Neurosci Lett, 2010, 472(2):94-98.

[14] Rentzos M, Zoga M, Paraskevas GP,etal. IL-15 is elevated in cerebrospinal fluid of patients with Alzheimer's disease and frontotemporal dementia[J]. J Geriatr Psychiatry Neurol, 2006, 19(2):114-117.

[15] Ishiguro M, Okada A, Asai K,etal. Stimulation of neuronal cells by culture supernatant of T lymphocytes triggered by anti-CD3 mAb followed by propagation in the presence of interleukin-2[J]. Microbiol Immunol, 2016, 60(1):47-55.

[16] Rentzos M, Rombos A, Nikolaou C,etal.Interleukin-15 and interleukin-12 are elevated in serum and cerebrospinal fluid of patients with amyotrophic lateral sclerosis[J]. Eur Neurol, 2010,63(5):285-290.

Clinical analysis of IL-6 and IL-15 in cerebrospinal fluid and serum of patients with amyotrophic lateral sclerosis

ZHENG Yong,ZANG Dawei*

(DepartmentofNeurology,TianjinFirstCenterHospital,Tianjin300192,China;*Correspondingauthor,E-mail:dwzang656@163.com)

ObjectiveTo investigate the changes of interleukin-6(IL-6) and interleukin-15(IL-15) in cerebrospinal fluid(CSF) and serum, and their correlation with amyotrophic lateral sclerosis(ALS).MethodsThe levels of IL-6 and IL-15 in cerebrospinal fluid and serum in 42 patients with ALS and 62 patients with non-inflammatory neurological disease(NIND) were detected by ELISA. The ALS function rating scale(ALSFRS-r) score was calculated and the disease progression rate(DPR) was calculated. The correlation between IL-6 and IL-15 levels and various clinical parameters was analyzed.ResultsThe levels of IL-6 and IL-15 were significantly higher in cerebrospinal fluid of ALS patients than those in serum of ALS patients(P<0.05). The levels of IL-6 and IL-15 in cerebrospnal fluid were positively correlated with DPR(P<0.01), but negatively correlated with duration of disease(P<0.01). IL-6 and IL-15 levels in cerebrospinal fluid of ALS patients were associated with patient survival(P<0.05).ConclusionIL-6 and IL-15 levels in cerebrospinal fluid are beneficial for disease differentiation and progression assessment of ALS. IL-6 and IL-15 levels in cerebrospinal fluid are more reliable than those in serum, and have potential clinical implications for disease diagnosis and progression.

amyotrophic lateral sclerosis; interleukin; disease progression rate; ALSFRS-r

天津市衛生局科技基金資助項目(2015KZ022)

鄭勇,男,1972-07生,學士,主治醫師,E-mail:pdadns@sina.com

2017-03-19

R745

A

1007-6611(2017)07-0702-04

10.13753/j.issn.1007-6611.2017.07.014