鈣調蛋白小亞基Capn4對依托鉑甙誘導的鼻咽癌細胞CNE2 DNA損傷修復的作用

王 豐，王 慧,吳麗賢,鄭 鳴*

(1福建中醫藥大學中西醫結合學院,福州 350004;2福建醫科大學藥學院藥理系;*通訊作者,E-mail:zming_1956@163.com)

鈣調蛋白小亞基Capn4對依托鉑甙誘導的鼻咽癌細胞CNE2 DNA損傷修復的作用

王 豐1，王 慧2,吳麗賢2,鄭 鳴2*

(1福建中醫藥大學中西醫結合學院,福州 350004;2福建醫科大學藥學院藥理系;*通訊作者,E-mail:zming_1956@163.com)

目的 研究鈣調蛋白小亞基Capn4對依托鉑甙(VP-16)誘導的鼻咽癌細胞CNE2 DNA損傷修復中的作用及可能影響的修復通路。 方法 構建shRNA下調Capn4表達的CNE2細胞并以Western blot法驗證;高內涵檢測γ-H2AX在CNE2細胞及下調Capn4表達的CNE2細胞中的平均熒光強度,分析下調Capn4對 VP-16誘導的CNE2細胞DNA損傷修復的作用;NHEJ(非同源重組修復)通路特異性的質粒EJ5-GFP用Fugen6 HD轉入CNE2細胞及下調Capn4的CNE2細胞,用高內涵儀檢測GFP的陽性率,觀察下調Canp4對VP-16誘導的鼻咽癌細胞DNA損傷NHEJ修復通路的影響。 結果 shRNA確實下調Capn4在鼻咽癌細胞中的表達。2.5 μmol/L VP-16處理CNE2Vector細胞和CNE2Capn4(-)細胞后6 h和12 h,CNE2Capn4(-)的損傷都較空載體的CNE2Vector細胞高;下調Capn4表達對VP-16造成的CNE2細胞DNA損傷修復有抑制作用(P<0.01)。2.5 μmol/L VP-16作用后,CNE2Capn4(-)細胞與CNE2Vector細胞相比較GFP平均熒光強度明顯更低;下調CNE2表達能夠抑制DNA損傷后NHEJ通路的修復(P<0.01)。 結論 在鼻咽癌細胞中下調Capn4的表達能抑制VP-16所致的DNA損傷修復,這種作用可能是通過抑制NHEJ通路實現的。

Capn4; 鼻咽癌; VP-16; shRNA; NHEJ通路

鼻咽癌是起源鼻咽上皮細胞的惡性腫瘤,發病率具有明顯的地域分布特征,在東南亞地區和中國南方有極高的發病率[1]。鼻咽癌的主要治療手段是放療,總體療效較好,但仍有較多患者存在放療照射野內局部的殘留和復發,提示在這部分患者中存在放療抵抗,這與DNA雙鍵斷裂[2]損傷修復機制(DNA damage repair,DDR)有密切的關系。不能修復的DSB將導致腫瘤細胞死亡。DNA修復主要通過兩種機制實現:一種是同源重組修復(HR),使用姐妹染色體的同源序列重新合成DNA;另一種是非同源重組修復(NHEJ),斷裂的DNA末端重新連接,可以在沒有模板的情況下進行DNA修復,但也更容易發生錯誤。DNA修復能力異常激活和增強是導致鼻咽癌細胞對DNA損傷劑耐藥的重要分子基礎;相反,修復缺陷則使腫瘤對放化療提高敏感性。依托泊苷(VP-16)是鬼臼毒素的半合成衍生物,誘導人鼻咽癌細胞產生DNA雙鏈損傷,有文獻報道VP-16誘導DNA損傷的同時,促進NHEJ修復,這可能是鼻咽癌化療抵抗的的原因之一[3]。鈣調蛋白Calpain[4]是Ca2+依賴半胱氨酸蛋白水解酶,Capn4是Calpain小分子亞基,分子量為28 kDa,使Calpain形成二聚體。目前在多種腫瘤中有發現Calpain的異常表達。Calpain參與多種腫瘤細胞的增殖和凋亡[5，6]。本研究擬研究鈣調蛋白小亞基Capn4對VP-16所致的鼻咽癌細胞CNE2 DNA損傷修復的作用及可能影響的修復通路。

1 材料與方法

1.1 細胞株和主要試劑

人鼻咽癌細胞CNE2購自中國科學院上海生命科學研究院細胞資源中心,293T細胞購自福建醫科大學細胞動物實驗中心。Capn4下調的人鼻咽癌細胞CNE2Capn4(-)和空載體轉染的對照細胞CNE2Vector為藥學院藥理實驗室構建。Hyclone RPMI1640 培養基和Hyclone胎牛血清均購于美國ThermoScientific。慢病毒質粒pGC-LV、包裝質粒pHelper 1.0和pHelper 2.0 購自上海吉凱基因化學技術有限公司。高內涵檢測γ-H2AX試劑盒購自美國Thermo scientific公司。VP-16注射液購自齊魯制藥有限公司。

1.2 細胞培養

CNE2細胞、293T細胞、CNE2Vector和CNE2Capn4(-)培養于含10%胎牛血清、青霉素100 IU/ml和鏈霉素100 μg/ml的RPMI 1640 培養液中,置37℃、5% CO2孵育箱中培養,取對數生長期細胞用于實驗。

1.3 構建shRNA載體轉染CNE2細胞抑制Capn4表達

Genbank中Capn4基因已知序列見圖1。

1 gggggcggtg cttgatatgg gagtagtctg attgtgtggg accaggacaa tgtggtcctg

61 aggggactga tgtggagttt tggcgggtgg ggcttatggg tctgggctca gcctgcattg

121 gctaacctgg agatgaacgt taaagcgagg cggctgcgca gtacaacccg gagcccccgc

181 ccccacgcac acattactcc aacattgagg ccaacgagag tgaggaggtc cggcagttcc

241 ggagactctt tgcccagctg gctggagatg acatggaggt cagcgccaca gaactcatga

301 acattctcaa taaggttgtg acacgacacc ctgatctgaa gactgatggt tttggcattg

361 acacatgtcg cagcatggtg gccgtgatgg atagcgacac cacaggcaag ctgggctttg

421 aggaattcaa gtacttgtgg aacaacatca aaaggtggca ggccatatac aaacagttcg

481 acactgaccg atcagggacc atttgcagta gtgaactccc aggtgccttt gaggcagcag

541 ggttccacct gaatgagcat ctctataaca tgatcatccg acgctactca gatgaaagtg

601 ggaacatgga ttttgacaac ttcatcagct gcttggtcag gctggacgcc atgttccgtg

661 ccttcaaatc tcttgacaaa gatggcactg gacaaatcca ggtgaacatc caggagtggc

721 tgcagctgac tatgtattcc tgaactggag ccccagaccc gccccctcac tgccttgcta

781 taggagtcac ctggagcctc ggtctctccc agggccgatc ctgtctgcag tcacatcttt

841 gtggggcctg ctgacccaca agcttttgtt ctctcagtac ttgttaccca gcttctcaac

901 atccagggcc caatttgccc tgcctggagt tccccctggc tctaggacac tctaacaagc

961 tctgtccacg ggtctcccca ttcccaccag gccctgcaca cacccactcc gtaacctctc

1021 ccctgtacct gtgccaagcc tagcacttgt gatgcctcca tgccccgagg gccctctctc

1081 agttctggga ggatgactcc agtccctgca cgccctggca cacccttcac ggttgctacc

1141 caggcggcca agctccagac cgtgccagac ccaggtgccc cagtgccttt gtctatattc

1201 tgctcccagc ctgccaggcc caggaggaaa taaacatgcc ccagttgctg atctctaaaa

1261 aaaaaaaaaa a

圖1 Genbank中Capn4基因已知序列
Figure 1 The known sequencing of Capn4 gene in Genbank

根據Genbank中Capn4基因已知序列,按siRNA序列設計原則,應用Ambion公司網上在線設計工具設計,并將選出的siRNA序列進行BLAST搜索,作同源性分析以保證序列的特異性,最后確定3個區段。根據capn4cDNA序列構建表達capn4 mRNA特異的,含綠色熒光蛋白基因(EGFP)的shRNA 真核表達質粒CAPNS1-RNAi。CAPNS1-RNAi作用的3個靶序列分別為5′-CCACAGAACTCATGAACAT-3′ (CAPNS1-RNAi89)、5′-AGGCCATATACAAACAGTT-3′(CAPNS1-RNAi90)及5′-ATGTTCCGTGCCTTCAAAT-3′(CAPNS1-RNAi91);陰性對照CON207作用的靶序列為:5′-TTCTCCGAACGTGTCACGT-3′。利用包裝質粒pHelper 1.0和pHelper 2.0轉染CNE2細胞,并用Western blot法測Capn4的表達情況。

1.4 高內涵技術檢測細胞DNA損傷

取對數生長期CNE2Vector和CNE2Capn4(-)細胞以適合的密度接種在96孔板中,次日細胞貼壁后,分組進行藥物處理,用不同濃度VP-16處理CNE2細胞2 h,高內涵技術檢測其DNA損傷情況,用2.5 μmol/L濃度作為造模損傷濃度,預處理CNE2細胞2 h,洗掉藥物,加入新培養基重新孵育,在0,6,12,24 h,檢測其DNA損傷情況;PBS洗滌2次,棄上清;每管加入100 μl固定液,室溫 15 min,離心棄上清,用100 μl Wash Buffer洗滌2 次,每次10 min,棄上清;每孔加入100 μl Permeabilization Buffer,室溫 15 min,離心棄上清,用100 μl Wash Buffer洗滌2次,每次10 min,棄上清;封閉。每孔加入100 μl 1× Blocking Buffer,室溫 15 min,離心棄上清;每孔加入50 μl一抗,室溫1 h,離心棄上清,用100 μl Wash Buffer Ⅱ洗滌2次,每次10 min,棄上清;用100 μl Wash Buffer Ⅱ洗滌2次,每次10 min,棄上清;每孔加入50 μl二抗,室溫避光45 min,離心棄上清,用100 μl Wash Buffer Ⅱ洗滌2 次,每次10 min,棄上清;用100 μl Wash Buffer Ⅱ洗滌2次,每次10 min,棄上清;每孔再加入新的200 μl Wash Buffer,將細胞轉移到96孔板中,平板離心機離心,上機檢測。

1.5 DNA損傷后NHEJ修復通路檢測

將NHEJ通路特異性的質粒EJ5-GFP用Fugen6 HD轉入CNE2Vector和CNE2Capn4(-)細胞,選擇穩定表達EJ5-GFP的CNE2/EJ5-GFP細胞,轉入pCBASceI質粒表達I-SceⅠ酶,切割EJ5-GFP基因,形成雙鏈斷裂(DSB),如果細胞通過NHEJ途徑修復將表達GFP,用高內涵儀檢測GFP的陽性率,可檢測出通過NHEJ修復的細胞。

1.6 統計學分析

2 結果

2.1 構建3株shRNA載體轉染CNE2細胞下調Capn4表達并以Western blot驗證

三株shRNA載體(CAPNS1-RNAi21291-1, CAPNS1-RNAi21290-1, CAPNS1-RNAi21289-2)構建成功并轉染CNE2,均下調Capn4在CNE2中的表達,其中CAPNS1-RNAi21289-2下調Capn4表達最顯著,差異有統計學意義(P<0.01,見圖1)。

1.CNE2； 2.CNE2Vector； 3.RNAi-21290-1；4.RNAi-21289-2； 5.RNAi-21291-1圖1 Western blot分析3株shRNA下調Capn4在CNE2中的表達Figure 1 Expression of Capn4 after transfected with three shRNA in CNE2 cells by Western blot

2.2 ArrayScanTM高內涵技術檢測VP-16對CNE2Vector和CNE2Capn4(-)細胞DNA損傷修復的影響

用不同濃度VP-16處理CNE2細胞2 h,高內涵技術檢測其DNA損傷情況,由圖2可以看到,隨著VP-16濃度的增加,其DNA損傷率呈濃度依賴性上升。用2.5 μmol/L濃度作為造模損傷濃度,預處理CNE2細胞2 h,洗掉藥物,加入新培養基重新孵育,在0,6,12,24 h,檢測其DNA損傷情況,由圖3可知,隨著時間的推延,DNA損傷逐漸被修復。

用2.5 μmol/L濃度VP-16處理CNE2Vector細胞和CNE2Capn4(-)細胞2 h,洗掉藥物,加入新培養基重新孵育,在0,6,12 h,高內涵檢測各組細胞γ-H2AX的平均熒光強度。結果顯示,在6 h和12 h,CNE2Capn4(-)的損傷都較空載體的CNE2Vector細胞高,差異有統計學意義(P<0.05見圖4)。

圖2 ArrayScanTM高內涵檢測VP-16對CNE2細胞DNA損傷的量效Figure 2 Effect of ArrayScan High-Content Systems on DNA damage and repair of CNE2Vectorand CNE2Capn4(-) cells treated with different doses of VP-16

2.3 NHEJ通路特異性的質粒轉染CNE2細胞后分析Capn4 對DNA損傷修復的作用

將NHEJ通路特異性的質粒EJ5-GFP用Fugen6 HD轉入細胞,選擇穩定表達EJ5-GFP的細胞株,轉入pCBASceI質粒表達I-SceⅠ。2.5 μmol/L的VP-16作用后,選取48 h時間點,用ArrayScanTM高內涵分析修復后的GFP平均熒光強度。結果顯示:在獲得I-SceⅠ限制性酶切位的表達EJ5-GFP的CNE2Capn4(-)細胞與CNE2Vector細胞細胞,以2.5 μmol/L的VP-16作用48 h,CNE2Capn4(-)細胞的GFP平均熒光強度明顯更低(P<0.01,見圖5)。

圖4 ArrayScanTM高內涵檢測VP-16對CNE2Vector細胞和CNE2Capn4(-)細胞DNA損傷修復的影響Figure 4 Effect of ArrayScan High-Content Systems on DNA damage and repair of CNE2Vectorand CNE2Capn4(-) cells

A.未加藥處理共同轉染EJ5-GFP和I-SceⅠ限制性酶切質粒的CNE2Vector細胞;B.VP-16作用48 h,共同轉染EJ5-GFP和I-SceⅠ限制性酶切質粒的CNE2 Vector細胞;C.未加藥共同轉染EJ5-GFP和I-SceⅠ限制性酶切質粒的CNE2Capn4(-)細胞;D.VP-16作用48 h,共同轉染EJ5-GFP和I-SceⅠ限制性酶切質粒的CNE2Capn4(-)細胞圖5 ArrayScanTM高內涵檢測VP-16對CNE2細胞NHEJ修復通路的影響 (×10)Figure 5 Effect of high content technique on NHEJ repair pathway in CNE2Vector and CNE2Capn4(-)cells (×10)

3 討論

鼻咽癌治療常使用的放療和化療方案往往通過損傷DNA來殺滅鼻咽癌細胞。DNA雙鍵斷裂(DNA double strain break,DSB)是最嚴重的DNA損傷方式[2]。在DNA損傷中,DSB對腫瘤細胞是最致命的打擊,它的修復主要通過兩種機制實現:一種是HR,使用姐妹染色體的同源序列重新合成DNA,需要Rad51[7],BRCA1[8]和BRCA2參與,這些蛋白在DNA損傷處形成聚集點(foci);另一種是NHEJ,斷裂的DNA末端重新連接,可以在沒有模板的情況下進行DNA修復,但也更容易發生錯誤,主要依賴Ku70/80異二聚體[9]與DNA依賴的蛋白激酶催化亞單位(DNA-PKcs)[10]結合形成DNA-PK全酶,后者募集XRCC4[11]和DNA連接酶Ⅳ完成NHEJ修復。DNA修復能力異常激活和增強是導致鼻咽癌細胞對DNA損傷劑耐藥的重要分子基礎;相反,修復缺陷則使腫瘤對其高敏感。因此,干擾鼻咽癌細胞DNA修復很可能增敏基于DNA損傷的鼻咽癌放化療作用。

本實驗中使用的依托泊苷(VP-16)是鬼臼毒素[3]的半合成衍生物,可誘導細胞產生DNA雙鏈損傷,臨床上廣泛用于治療急性粒細胞白血病等惡性腫瘤。在真核細胞中,外源性化學、物理及生物性物質所致的DSB都可能會觸發H2AX的快速磷酸化,從而形成γ-H2AX。實驗研究中,γ-H2AX可通過Western blotting法檢測,或應用免疫熒光技術,可以清楚地觀測到以γ-H2AX焦點形成為特征的DNA雙鏈斷裂的區域,這種染色質的改變通常被認為是細胞對DSB做出的敏感反應。目前,γ-H2AX的水平已經成為公認的DSBs發生早期的標志[12]。因此本實驗用高內涵技術檢測γ-H2AX焦點情況來判斷DNA損傷水平。

Capn4(又稱CapnS1)是calpain蛋白的一個小分子調節亞基,在調節calpain的穩定性和活性中發揮著至關重要的作用。多項研究表明Capn4的缺失引起calpain-1和calpain-2功能障礙。在轉基因小鼠中的研究顯示敲除Capn4基因可顯著降低calpain活性,從而影響小鼠的正常發育,導致胚胎早期死亡;敲除Capn4 能降低成纖維細胞的遷移和黏附能力。最近的研究報道Capn4在肝細胞癌和肝內膽管上皮細胞癌中高表達[13，14],而且Capn4表達程度與患者的預后密切相關。干擾Capn4的表達能夠顯著降低肝細胞癌和肝內膽管上皮細胞癌的細胞侵襲和遷移能力。本課題組前期工作表明,無論是在mRNA水平還是在蛋白水平,新鮮細針穿刺活檢鼻咽癌組織中的Capn4表達要明顯高于正常鼻咽組織。而且,EB病毒感染者Capn4陽性表達率高于無EB病毒感染;腫瘤分化程度越高,Capn4的陽性表達率越低;腫瘤分期越晚,Capn4的陽性表達率越高;出現遠處及淋巴結轉移的陽性表達率要明顯高于未轉移的。Kaplan-Meier生存期分析顯示Capn4在鼻咽癌中表達的程度與鼻咽癌患者的預后密切相關,Capn4高表達的患者總生存期、無進展生存期均低于低表達者。從而表明Capn4在鼻咽癌惡性生物學行為中起著重要的作用。

本實驗結果顯示,下調Capn4的表達對VP-16誘導的CNE2細胞DNA損傷修復有抑制作用,而這種抑制作用可能是通過抑制NHEJ通路完成的。有報道顯示[15],鈣離子內流能使m-Calpain從胞質轉位到胞核,從而水解Ku80,裂解的Ku80能夠促進DNA雙鏈斷裂的修復活性。故而轉位的m-Calpain通過Ku80的裂解促進了NHEJ通路修復。這一結論與我們實驗結果一致。而Capn4與NHEJ修復通路上哪些蛋白相互作用以及是否影響細胞周期蛋白尚待進一步研究。Capn4的抑制可能成為鼻咽癌放化療后抑制DNA損傷修復的重要因素。

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Effect of Capn4 on DNA damage repair of nasopharyngeal carcinoma cell CNE2 induced by VP-16

WANG Feng1,WANG Hui2,WU Lixian2,ZHENG Ming2*

(1CollegeofIntegrativeMedicine,FujianUniversityofTCM,Fuzhou350004,China;2DepartmentofPharmacology,FujianMedicalUniversity;*Correspondingauthor,E-mail:zming_1956@163.com)

ObjectiveTo investigate the effect of Capn4 on the repair of nasopharyngeal carcinoma cell line CNE2 induced by VP-16 and its possible pathways.MethodsThe Capn4 knockdown CNE2 cells using shRNA were constructed and further identified by Western blot. ArrayScan High-Content Systems were used to analyze the mean fluorescence intensity of γ-H2AX in CNE2 cells and CNE2 cells with down-regulation of Capn4. Non-homologous end joining(NHEJ) pathway-specific plasmid EJ5-GFP was transfected into CNE2 cells and CNE2 cells with down-regulated Capn4 by Fugen6 HD. The positive rate of GFP was detected by ArrayScan High-Content Systems. And the effect of Canp4 down-regulation on VP-16-induced DNA damage NHEJ pathway in CNE2 cells was observed.ResultsThe shRNA inhibited Capn4 expression in CNE2 cells. After treated with 2.5 μmol/L VP-16 for 6 h and 12 h, the damages of CNE2Capn4 (-)cells were higher than those of CNE2Vectorcells. Down-regulation of Capn4 expression inhibited the DNA damage of CNE2 cells induced by VP-16(P<0.01).Compared with CNE2Vectorcells, the GFP average fluorescence intensity of the CNE2Capn4 (-)cells after treated with 2.5 μmol/L VP-16 was significantly lower. Down-regulation of Capn4 expression inhibited the repair of NHEJ pathway in CNE2 cells after DNA damage(P<0.01).ConclusionDown-regulation of Capn4 expression can inhibit radiation-induced DNA damage repair, which may be achieved by inhibition of NHEJ pathway.

Capn4; nasopharyngeal carcinoma; VP-16; shRNA; NHEJ pathway

國家自然科學基金資助項目(81572662)

王豐,女,1979-02生，碩士,講師,E-mail:fangfei1931@126.com

2017-03-26

R739.6

A

1007-6611(2017)07-0685-06

10.13753/j.issn.1007-6611.2017.07.010