不同培養體系對小鼠胚胎體外發育的影響

邵明清,邵南齊,劉旭光

(1臨汾市第四人民醫院生殖醫學科,臨汾 041000;2鄭州澍青醫學院藥理學教研室;3安徽農業大學動物科技學院;*通訊作者,E-mail:liuxuguang@ahau.edu.cn)

不同培養體系對小鼠胚胎體外發育的影響

邵明清1,邵南齊2,劉旭光3*

(1臨汾市第四人民醫院生殖醫學科,臨汾 041000;2鄭州澍青醫學院藥理學教研室;3安徽農業大學動物科技學院;*通訊作者,E-mail:liuxuguang@ahau.edu.cn)

目的 探討不同的培養液、不同培養方法及培養氣相對小鼠胚胎體外發育的影響。 方法 將小鼠胚胎按不同品牌的培養液分為Cook,Quinns,Vitrolife組,這3個組以體外受精的方式獲得胚胎,比較小鼠胚胎受精率、卵裂率、囊胚率;按不同的培養方法分為:單胚培養組、WOW(又叫滴中孔)組、群胚培養組,這3個組以體內受精的方式獲得胚胎,比較小鼠胚胎卵裂率、囊胚率;按培養氣相分為兩氣組、三氣組,這2個組以體內受精的方式獲得胚胎,比較小鼠胚胎卵裂率、囊胚率、碎片率。 結果 在培養液方面,Quinns組的受精率(90.7%)最高,Quinns,Cook,Vitrolife三組培養液在卵裂率方面差異沒有統計學意義(85.4%,84.0%,84.9%，P>0.05)；在囊胚率上,Vitrolife組(89.6%)最高,三組差異沒有統計學意義(P>0.05)。在培養方法上,三組卵裂率(85.5%，91.1%，89.3%)差異沒有統計學意義(P>0.05),群胚培養組和WOW組囊胚率(89.1%，88.1%)顯著高于單胚培養組(77.5%，P<0.05)。在氣相方面,兩組卵裂率(74.7%，92.6%)和囊胚率(76.4%，90.9%)差異有統計學意義(P<0.05)。 結論 不同的培養液、不同培養方法及培養氣相對小鼠胚胎體外發育有不同的影響,選用Quinns培養液受精和Vitrolife培養液做后續培養,使用群胚培養法在三氣(6%CO2、5%O2和89%N2)的氣相環境里培養,小鼠胚胎體外發育可以獲得較高的囊胚率和較低的碎片率。

胚胎發育; 培養體系; 小鼠

影響胚胎發育的培養體系包括:培養液、培養密度、氣相、受精方式等[1]。如何建立最佳的體外胚胎發育培養體系是目前生殖醫學領域研究的重點之一。近幾年在培養體系方面有了一定的改進,但是受精率低、胚胎培養過程中碎片多、優質囊胚率低、妊娠率低等問題依然存在,這些問題依然困擾著臨床醫生和實驗室工作人員,是臨床促排卵的問題,還是實驗室培養的問題，值得深入研究。

目前商品化的培養液主要有Quinns、Cook、Vitrolife等品牌,本次研究以昆明小鼠為試驗材料,探討不同的培養液、不同培養密度及培養氣相對小鼠胚胎體外發育的影響,目的在于尋找一種適合昆明小鼠胚胎的培養液及培養環境,優化小鼠胚胎體外培養體系,進而為人類胚胎的體外培養提供相關依據。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

4-6周齡雌性昆明小鼠80只,10-12周齡雄性昆明小鼠20只,購自鄭州大學實驗動物中心,微生物級別:SPF,生產許可證號(SCXK(豫)2015-0005)。適應性飼養1周,排除應激反應,將精神狀態欠佳者剔除。

1.2 主要試劑與儀器

孕馬血清(PMSG),寧波第二激素廠生產;人絨毛膜促性腺激素(HCG),南京動物激素廠生產;培養液:Quinns、Cook、Vitrolife公司生產;血清白蛋白代用品(HSA),Cook公司生產。培養皿及圓底試管由美國Falcon公司生產;移液管及錐形試管由美國BD公司生產;CO2培養箱(Galaxy 48)由英國Galaxy生產;倒置顯微鏡(NikonTi)由日本Nikon生產;IVF工作站(K-systems 426Dual)由丹麥Sterile生產。

1.3 實驗方法

本實驗共分8個組,按不同品牌的培養液分為Cook,Quinns,Vitrolife組,這3個組研究培養液對小鼠胚胎體外發育的影響;按不同的培養方法分為:單胚培養組(每個微滴30 μl,每個微滴放一枚胚胎)、WOW(well of the well,WOW,又叫滴中孔,每孔一個胚胎)組、群胚培養組(每個微滴10個胚胎),這3個組研究不同培養方法對小鼠胚胎體外發育的影響;按培養氣相分為兩氣組(6%CO2和94%空氣的混合氣體)、三氣組(6%CO2、5%O2和89%N2的混合氣體),這2個組研究不同培養氣相對小鼠胚胎體外發育的影響。

本文中涉及到的公式如下:受精率=(受精卵數/獲卵總數)×100%,卵裂率=(受精卵裂胚胎數/受精卵數)×100%,囊胚率=(形成囊胚數/所有囊胚培養的胚胎數)×100%。

1.4 小鼠體外受精胚胎在不同培養液里的發育

1.4.1 小鼠體外受精胚胎的準備 13:00時取雌性小鼠,每批取6只,每只雌鼠腹腔內注射PMSG 10 IU,經過48 h腹腔內注射HCG 10 IU,再經過17 h頸椎脫臼法處死雌鼠,無菌條件下取出輸卵管,將卵丘卵細胞復合體收集到500 μl分別含有Quinns、Cook、Vitrolife品牌的受精液的培養皿中,放入37 ℃、6.0% CO2、90%以上相對濕度的培養箱中。

頸椎脫臼法處死雄鼠,在無菌條件下取出附睪尾,放入Quinns、Cook、Vitrolife液中,用1 ml注射器刺破附睪尾,精子自由游出,放入37 ℃、6.0% CO2、90%以上相對濕度的培養箱中獲能60 min。

將獲能的精子加入卵丘卵細胞復合體液滴內,精卵結合6 h,取出受精卵,分別放進提前平衡過的含Quinns、Cook、Vitrolife品牌的卵裂液的培養皿培養。

1.4.2 小鼠體外受精胚胎的觀察 第1天把含胚胎的培養皿放在倒置顯微鏡的載物臺上,觀察卵裂情況并記錄,每隔24 h觀察一次,直至囊胚的形成。

1.5 小鼠受精卵在不同培養方法中的發育

1.5.1 小鼠受精卵的采集及培養 超排方法同1.4.1,HCG注射后按雌雄比例1 ∶1合籠,次日8:00時檢查陰栓,將陰栓陽性小鼠處死,取出受精卵,隨機分為3組,分別是單胚培養組、群胚培養組和WOW組進行培養,放進提前平衡過的Quinns、Cook、Vitrolife液滴內。

1.5.2 受精卵的觀察 第1天把含胚胎的培養皿放在倒置顯微鏡的載物臺上,觀察卵裂情況并記錄,每隔24 h觀察一次,直至囊胚的形成。

1.6 小鼠受精卵在不同的培養氣相中的發育

受精卵獲得同1.5.1,自然受精后的形態正常的原核胚隨機分為兩組,分別使用6% CO2和94 %空氣的混合氣體;另一種培養氣相是6% CO2、5% O2和89% N2的氣體環境,觀察小鼠原核胚體外發育情況,統計分析不同組別胚胎的卵裂率、囊胚率、碎片率。

1.7 統計學分析

采用SPSS16.0軟件的One-Way ANOVA模塊對不同組別的實驗數據進行統計分析,P<0.05為差異有統計學意義,每組實驗重復3次。

2 結果

2.1 不同培養液對小鼠胚胎體外發育的影響

分別在Quinns,Cook,Vitrolife三組培養液中培養小鼠胚胎,觀察到的發育情況(見圖1)。Quinns組的卵子受精率最高,Quinns、Cook、Vitrolife三組培養液在卵裂率差異沒有統計學意義(P>0.05，見表1),在囊胚率差上Vitrolife組最高,差異沒有統計學意義(P>0.05，見表1)。三種培養液均適宜培養人類胚胎。

A 原核期胚胎; B 卵裂期胚胎; C 囊胚圖1 小鼠胚胎體外發育情況(×200)Figure 1 In vitro development of mouse embryos(×200)

表 1 不同培養液對小鼠胚胎體外發育的影響

Table 1 Effects of different culture media on the development of mouse embryos

組別n受精率(%)卵裂率(%)囊胚率(%)Cook150847(127/150)840(126/150)850(107/126)Quinns151907(137/151)854(129/151)891(115/129)Vitrolife159862(137/159)849(135/159)896(121/135) P>005>005>005

2.2 不同培養方法對小鼠胚胎體外發育的影響

自然受精后的小鼠原核胚隨機分為3組,分別進行單胚培養、WOW組培養、群胚培養(每組10個胚胎),觀察各組胚胎的發育情況。卵裂率三組差異沒有統計學意義(P>0.05);囊胚率群胚培養組和WOW組顯著高于單胚培養組(P<0.05,見表2)。結果表明,小鼠胚胎使用WOW組和群胚培養法的培養效果較佳。

表 2 不同培養方法對小鼠胚胎體外發育的影響

Table 2 Effects of different culture methods on the development of mouse embryos

組別胚胎數(枚)卵裂率(%)囊胚率(%)單胚培養組83855(71/83)775(55/71)群胚培養組101911(92/101)891(82/92)WOW組75893(67/75)881(59/67) P>005<005

2.3 不同培養氣相對小鼠胚胎體外發育的影響

自然受精后的原核胚隨機分為兩組,一種培養氣相是兩氣(6% CO2和94%空氣的混合氣體);另一種培養氣相是三氣(6% CO2、5% O2和89% N2)的氣體環境,觀察各組胚胎的發育情況。兩組卵裂率和囊胚率差異有統計學意義(P<0.05,見表3)，三氣組顯著高于兩氣組,結果表明,小鼠胚胎使用培養氣相是6% CO2、5% O2和89% N2的氣體環境的培養效果較佳。通過胚胎碎片的比較,結果顯示:胚胎中所含碎片比例為0%-5%,6%-20%,>20%在兩組中分別為19.8%與48.4%，36.3%與32.6%，44.0%與18.9%，兩組比較差異有統計學意義(P<0.05，見表4)。說明碎片的多少與氣相有一定的關系,分裂及生長速度三氣組明顯優于兩氣組。

表 3 不同培養氣相對小鼠胚胎體外發育的影響

Table 3 Effects of different gas conditions on the development of mouse embryos

組別胚胎數(枚)卵裂率(%)囊胚率(%)兩氣組91747(68/91)764(52/68)三氣組95926(88/95)909(80/88)P<005<005

表 4 不同培養氣相對小鼠胚胎碎片的影響

Table 4 Effects of different gas conditions on the fragmentation of mouse embryos

組別胚胎數(枚)碎片率(%)0%-5%6%-20%>20%兩氣組91198(18/91)363(33/91)440(40/91)三氣組95484(46/95)326(31/95)189(18/95)P<005>005<005

3 討論

培養液發展經歷了從單一培養基到序貫培養基的發展歷史[1],簡單培養基由幾種常規無機鹽類并添加能量底物,而復雜培養基除這些成分以外,還含有維生素、氨基酸、嘌呤、核苷酸及微量表面活性劑等諸多成分[1]。在體外培養的不同時間,胚胎對培養液的成分會有不同的要求,使用單一培養液顯然是不夠的。

培養液的穩定性直接決定胚胎培養結局,因此,選擇生產工藝成熟廠家的培養液至關重要,由于商業機密的原因,大多培養液的具體配方沒有公開,因此,新進培養液必須進行質控,只有質控合格的培養液才能用于人類胚胎的培養,否則,一時的疏忽,可能給患者帶來意想不到的后果。本研究涉及的三個品牌的培養液Quinns、Cook、Vitrolife培養液在卵裂率、囊胚率上差異沒有統計學意義(P>0.05),Quinns組的受精率最高,三組培養液均適宜培養人類胚胎,與宋冰冰等[2]的結果類似。

目前常用的胚胎培養方法主要有:微滴法、WOW法、群胚培養法等[3],微滴法原理是將胚胎聚集在一個較小的區域以達到充分利用自分泌和旁分泌效應的目的,微滴的體積一般為10-50 μl。WOW培養法,由于胚胎之間相互隔離,且每枚都位于WOW中,不但可以使胚胎分泌的一些因子不被稀釋以自分泌方式作用于自身,還可以阻止有毒物質作用于正常胚胎。本次研究結果表明:單胚培養組、WOW組、群胚培養組胚胎的發育情況在卵裂率水平上,三組差異沒有統計學意義(P>0.05);在囊胚率上,群胚培養組和WOW組顯著高于單胚培養組(P<0.05)。在多種動物模型上的研究表明[4],增加培養密度可以提高胚胎的發育潛能,可能與胚胎自分泌或旁分泌效應有關。基于上述效應,培養過程中使用體積較小的培養液滴并縮小液體表面積促使營養因子盡可能聚集濃縮可顯著提高胚胎的發育潛能[5]。

但是對于人類胚胎,需要對每個胚胎都要進行細致的觀察,群胚培養無法區別多精受精的情況,因此還是單胚培養,從本次研究看,群胚培養組和WOW組顯著高于單胚培養組,有報道用WOW系統培養牛的胚胎[6],兼有單胚培養與群胚培養的優勢,WOW培養體系的半開放環境不僅稀釋了培養過程中堆積的代謝產物(如氨、自由基等)的毒性作用,而且還在每個微孔內的胚胎周圍聚集了胚胎自分泌或者旁分泌的生長因子,進而促進胚胎的發育。此法能否用于人的胚胎培養,仍需要進行更加深入的研究。鑒于自制WOW培養皿時,燒燙塑料培養皿會有有害物質產生,如果有商品化的WOW培養皿,效果會好一點。

除培養基、培養方法外,培養氣相也是影響胚胎培養效果的一個重要因素。本次研究表明:在卵裂率和囊胚率上,兩氣組和三氣組差異有統計學意義(P<0.05),原因在于三氣組中低氧可減少培養中自由基和活性氧(ROS)的形成,而活性氧對細胞有毒害作用,易造成DNA損傷和脂質過氧化反應[7]。而高氧環境(體積分數20% O2)會產生更多的活性氧,從而影響胚胎的發育潛能[8]。

低氧除要求氣相中氧氣含量低外,還要求實驗室人員操作胚胎時要迅速,減少胚胎在空氣中的暴露時間,特別是做卵泡漿內單精子注射(ICSI)時,應該先把精子制動后,再把卵子轉移到ICSI皿中,再者,觀察胚胎要迅速。胚胎在體外培養時,要盡量減少培養液pH的變化,pH與CO2存在一定的關系,適宜的酸堿度是維持胚胎正常發育的重要條件,一旦環境的pH值發生改變,將會影響胚胎的發育。碎片是胚胎體外培養中經常出現的現象,產生原因可能與配子的質量、實驗室的環境質量如溫度或pH變化及促排卵用藥方案有關。本次研究顯示,在三氣組的氣相環境中,碎片較兩氣組中少,可能與低氧環境產生更少的活性氧有關。龍鼎新等[9]實驗結果表明,較低或較高的pH環境均可以降低胚胎的存活率,增加致畸率和死亡率,最終表現為胚胎發育異常或死亡。因此,胚胎培養的外界環境要盡量與體內環境一致,本次實驗表明胚胎在6% CO2、5% O2和89% N2的氣相環境中可以取得較好的發育效果。

由于受實驗條件的限制,本實驗室的培養體系還是靜態培養體系,今后研究的方向應該是動態培養體系,如搖動/轉動體系、傾斜培養體系、振動培養體系、控制液體流動培養體系等,時差成像系統(time-lapse imaging,TLI)作為一種新的動態觀察胚胎培養體系,越來越受到臨床醫生與胚胎學家的青睞。胚胎學家應用這一系統后,可以通過視頻圖像連續觀察其整個動態發育過程,而不需將胚胎從培養箱中取出。但TLI系統的安全性有待進一步評估[10]。再者儀器昂貴,限制了在一般生殖中心的推廣。因此,對大多數剛開展的生殖中心來說,還是應該采用成熟的培養體系。

本研究的結果表明,不同的培養液、不同培養方法及培養氣相對小鼠胚胎體外發育的有不同的影響,選用Quinns培養液受精和Vitrolife培養液做后續培養,使用群胚培養法在三氣(6%CO2、5%O2和89%N2)的氣相環境里培養小鼠胚胎,可以獲得較高的囊胚率和較低的碎片率。

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Effect of different culture systems oninvitrodevelopment of mouse embryos

SHAO Mingqing1,SHAO Nanqi2,LIU Xuguang3*

(1ReproductiveCenterofLinfenFourthPeople’sHospital,Linfen041000,China;2DepartmentofPharmacologyofZhengzhouShuqingMedicalCollege;3CollegeofAnimalScienceandTechnologyofAnhuiAgriculturalUniversity;*Correspondingauthor,E-mail:liuxuguang@ahau.edu.cn)

ObjectiveTo investigate the effects of different culture media, different culture methods and culture gas on theinvitrodevelopment of mouse embryos.MethodsThe mouse embryos was divided into Cook group, Quinns group, Vitrolife group according to different brands of culture medium. The embryos were obtained byinvitrofertilization among three groups, and the fertilization rate, cleavage rate and blastocyst rate were compared. According to different culture methods, the experiment was divided into single embryo culture group, WOW group and multiple embryos group. The embryos were obtained byinvivofertilization among these groups to compare cleavage rate and blastocyst rate.According to the culture phase, the experiment was divided into two gas group and three gas group. The embryos were obtained byinvivofertilization in the two groups to compare the cleavage rate, blastocyst rate and Fragmentation rate.ResultsThe fertilization rate was the highest in Quinns group(90.7%).There was no significant difference in cleavage rate among three groups(85.4%,84.0%,84.9%,P>0.05).The blastocyst rate was the highest in Vitrolife group(89.6%), and there was no significant difference among three groups(P>0.05). There was no significant difference in cleavage rate among three culture methods(P>0.05). Blastocyst rates in multiple embryos group and WOW group were significantly higher than that of single embryo culture(89.1%,88.1%vs77.5%,P<0.05). There was significant difference in cleavage rate(74.7%,92.6%) and blastocyst rate(76.4%,90.9%) between two culture gas groups(P<0.05).ConclusionThe different culture medium, different culture methods and culture gas have different effects on mouse embryo developmentinvitro.The results suggest that Quinns medium as fertilization media,Vitrolife media as the following culture media, multiple embryos group culture method and three gas(6%CO2, 5%O2and 89%N2) as culture environment can have higher blastocyst rate and lower fragmentation rateinvitrodevelopment of mouse embryos.

embryo development; culture system; mouse

安徽省科研資助計劃項目(自然科學)(2006jq1128)

邵明清,男,1982-02生,碩士,實驗師,E-mail:shaomingqing@126.com

2017-03-19

S814.8

A

1007-6611(2017)07-0654-05

10.13753/j.issn.1007-6611.2017.07.004