補(bǔ)腎、健脾、活血法對去卵巢致骨質(zhì)疏松癥大鼠骨骼、骨骼肌IкBα含量影響的對比研究

金成日 姜奧 楊芳

1.遼寧中醫(yī)藥大學(xué)附屬第四醫(yī)院，遼寧 沈陽 110100 2.沈陽市第五人民醫(yī)院，遼寧 沈陽 110023 3.遼寧中醫(yī)藥大學(xué)，遼寧 沈陽 110847

骨質(zhì)疏松癥(osteoporosis，OP)是以骨組織顯微結(jié)構(gòu)受損，骨礦成分和骨基質(zhì)等比例不斷減少，骨質(zhì)變薄，骨小梁數(shù)量減少，骨脆性增加和骨折危險度升高的一種全身骨代謝障礙的疾病，是中老年人群最常見的骨骼疾病。2001年美國國立衛(wèi)生研究院(NIH)提出的“骨質(zhì)疏松癥”的定義為，以骨強(qiáng)度下降、骨折風(fēng)險增加為特征的骨骼系統(tǒng)疾病。隨著我國人口老齡化日趨明顯，骨質(zhì)疏松癥必將成為老齡化社會需面對的公共健康問題。

目前，針對骨質(zhì)疏松癥的中醫(yī)研究多是基于“腎藏精主骨”理論論述其病因病機(jī)，而從“脾主四肢肌肉”探討其病因病機(jī)的較少。本實(shí)驗(yàn)研究采用分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)方法，以骨質(zhì)疏松癥大鼠的骨骼、骨骼肌IкBα為檢測指標(biāo)，觀察骨骼肌收縮與骨骼協(xié)調(diào)性對骨質(zhì)疏松癥形成的影響，同時探討中醫(yī)不同治法對骨質(zhì)疏松癥的防治效果和作用機(jī)制的異同。

1 材料和方法

1.1 主要儀器設(shè)備

Infinite M200多功能酶標(biāo)儀、MR1822低溫高速離心機(jī)。

1.2 主要試劑

IкBα試劑盒(AMEKO 公司)內(nèi)含：96 微孔板、一抗液、樣品稀釋液、酶標(biāo)抗體液、底物稀釋液、洗滌液。

1.3 實(shí)驗(yàn)動物

選用清潔級Wistar大鼠60 只，雌性且未曾交配，體重(200±50)g，4～5月齡。由北京維通利華實(shí)驗(yàn)動物技術(shù)有限公司提供，實(shí)驗(yàn)動物質(zhì)量合格證號：1100170659。

術(shù)前將大鼠按照隨機(jī)分組的方法分為正常組(8只)、手術(shù)組(52只)。采用摘除大鼠雙側(cè)卵巢的方法致骨質(zhì)疏松癥模型。術(shù)后7d 將手術(shù)組存活的大鼠隨機(jī)分為4組(每組8只)，即：模型組、補(bǔ)腎方組、健脾方組和活血方組。

1.4 藥品

補(bǔ)腎組選用左歸丸，制備方法: 按大鼠每千克體重一日藥量計算，熟地2.52 g、山藥1.26 g、枸杞子1.26 g、山茱萸1.26 g、川牛膝1.26 g、菟絲子1.26 g、鹿角膠(河南老君堂制藥有限公司，國藥準(zhǔn)字241020792) 1.26 g，龜板膠(河南老君堂制藥有限公司，國藥準(zhǔn)字241020792) 1.26g 打碎、烊化，混合上述顆粒劑，加20 mL水。健脾組選用補(bǔ)中益氣顆粒(北京漢典制藥有限公司)。活血組選用身痛逐瘀湯 (遼寧中醫(yī)藥大學(xué)藥廠)。

1.5 實(shí)驗(yàn)方法

1.5.1造模：用10%水合氯醛將通過肌肉注射麻醉大鼠，麻醉后的大鼠采用俯臥位姿勢固定于自制的手術(shù)臺上，從腰背部脊柱兩側(cè)作縱行切口切開皮膚及肌肉，摘除兩側(cè)卵巢組織后逐層縫合，關(guān)閉創(chuàng)口。正常組不手術(shù)。

1.5.2給藥：術(shù)后第7 d 開始給藥，每日上午灌胃1 次，連續(xù)灌胃12 w。補(bǔ)腎組、健脾組和活血組的大鼠，每日用藥量按成人用藥量的6.3 倍計算，大鼠胃容量為0.875 mL/100 g。正常組和模型組以等量生理鹽水注射灌胃。灌胃期間，每周一對大鼠稱重1次，按照體重調(diào)整給藥劑量。

1.5.3取材：第12 周大鼠灌胃結(jié)束，禁食24 h 后取材。用10%水合氯醛將大鼠肌肉注射麻醉后取材。無菌條件下取大鼠右后肢腓腸肌的白肌部分和左后肢的全股骨，放入高壓滅菌的EP 管內(nèi)，做好標(biāo)記后放入-70 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.6 檢測指標(biāo)及方法

用ELISA 方法檢測實(shí)驗(yàn)大鼠骨骼、骨骼肌IкBα含量，用酶聯(lián)儀在450 nm 波長依序測量各孔的吸光度(OD值)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，計算樣品的實(shí)際濃度。具體操作方法按試劑盒說明書進(jìn)行。

1.7 統(tǒng)計學(xué)處理

2 結(jié)果

與正常組比較，模型組大鼠離體股骨上1/3骨密度極顯著降低(P<0.01)；與模型組比較，各治療組大鼠股骨上1/3骨密度均有不同程度的升高(P<0.01)，其中以補(bǔ)腎中藥組升高最為顯著(表1)。

與正常組比較，模型組大鼠骨骼的IкBα含量顯著降低(P<0.01)；與模型組比較，補(bǔ)腎組、健脾組、活血組大鼠骨骼的IкBα含量明顯升高(P<0.01)，其中補(bǔ)腎組升高程度比較明顯，其次為健脾組(表2)。

與正常組比較，模型組大鼠骨骼肌的IкBα含量顯著降低(P<0.01)；與模型組比較，補(bǔ)腎組、健脾組、活血組大鼠骨骼肌的IкBα含量均有升高，但與模型組比較無統(tǒng)計學(xué)意義(表3)。

組別n骨組織正常組80.177±0.007模型組80.132±0.018?補(bǔ)腎組80.165±0.006?▲健脾組80.153±0.003?▲活血組80.157±0.005?▲

注：與正常組比較,*P<0.01；與模空組比較,▲P<0.01

組別 n骨組織正常組87.090±0.09模型組83.102±0.27?補(bǔ)腎組84.585±0.18?▲健脾組84.350±0.34?▲活血組83.515±0.13?▲

注：與正常組比較，*P<0.01；與模型組比較，▲P<0.01

組別 n骨骼肌正常組87.078±0.18模型組84.325±0.55?補(bǔ)腎組84.325±0.26?健脾組84.591±0.44?活血組84.257±0.16?

注：與正常組比較，*P<0.01；與模空組比較，▲P<0.01

3 討論

3.1 “脾腎相關(guān)”與骨骼、肌肉的關(guān)系

中醫(yī)學(xué)認(rèn)為腎為先天之本，“腎在體合骨”，指骨的生長發(fā)育，有賴于骨髓的充盈及其所提供的營養(yǎng)，腎精充足，骨髓生化有源，骨骼得到髓的滋養(yǎng)，才能堅固有力。若腎精不足，骨髓生化乏源，骨骼失去營養(yǎng)，而骨質(zhì)脆弱無力。清代醫(yī)家唐容川在《醫(yī)經(jīng)精義》中說到：“腎藏精，精生髓，髓生骨，故骨者，腎之所合也；髓者，腎精所生，精足則髓足；髓在骨內(nèi)，髓足者則骨強(qiáng)”。人到了中老年時期，腎中精氣開始逐漸虧虛，骨髓化源不足，骨骼失去滋養(yǎng)而骨質(zhì)脆弱疏松，容易出現(xiàn)骨質(zhì)脆弱、腰膝酸軟、易于骨折等癥狀，因此中老年人群易發(fā)原發(fā)性骨質(zhì)疏松癥。女性至七七后，任脈虛、太沖脈衰少、天癸竭，腎精不足而不能維持骨骼的正常功能，因此絕經(jīng)后的女性也易發(fā)骨質(zhì)疏松癥。因此，腎虛是骨質(zhì)疏松癥發(fā)病的根本原因，補(bǔ)腎方法是臨床治療該病的根本方法。

中醫(yī)學(xué)認(rèn)為脾為后天之本，主四肢肌肉，為氣血生化之源。脾對骨骼的生長也具有一定的作用，若脾失健運(yùn)，四肢肌肉得不到充分的營養(yǎng)，同時腎失所藏，后天之精又不得以補(bǔ)充，腎精不足，筋骨失養(yǎng)，則骨痿不用。在《素問·生氣通天論》中提到：“是故謹(jǐn)和五味，骨正筋柔，氣血以流，腠理以密，如是則骨氣以精，謹(jǐn)?shù)廊绶ǎL有天命。”《靈樞·本神》也提到：“脾氣虛則四肢不用”。“金元四大家”之李東垣在《脾胃論》中亦提到“大抵脾胃虛弱，陽氣不能生長，是春夏之令不行，五臟之氣不生。脾胃則下流乘腎，……則骨乏無力，是為骨痿。令人骨髓空虛，足不能履地，是陰氣重疊，此陰盛陽虛之癥。”可見，“脾腎相關(guān)”而肌肉和骨骼的關(guān)系十分密切。

3.2 IкBα含量的變化對骨質(zhì)疏松癥影響

核因子Kappa B(NF-κB)是一種能與免疫球蛋白κ 輕鏈基因增強(qiáng)子κB序列特異結(jié)合并調(diào)節(jié)κ輕鏈轉(zhuǎn)錄的核蛋白因子。NF-κB 可以參與細(xì)胞生長、分化及炎癥反應(yīng)等基因表達(dá)調(diào)控，在很多常見的情況下出現(xiàn)NF-κB 的異常激活或抑制，如腫瘤、糖尿病、動脈粥樣硬化等[1-3]。NF-κB 在基因的調(diào)節(jié)表達(dá)的功能是多方面的，NF-κB 二聚體與其NF-κB 抑制因子(IκB) 家族的成員結(jié)合，以無活性的三聚體形式存在于胞漿中。經(jīng)典的IκB 家族成員有IκBα、IκBβ、IκBε。IκBα主要通過經(jīng)典旁路途徑調(diào)節(jié)Rel/p50 異源二聚體。

成骨細(xì)胞增殖分化的抑制或成骨細(xì)胞凋亡進(jìn)程的加速，能使骨形成少于骨吸收從而導(dǎo)致OP的發(fā)生，而NF-κB 信號通路在成骨細(xì)胞的增殖分化和凋亡過程中都有著重要的作用。研究[4]表明導(dǎo)致骨質(zhì)疏松癥NF-κB 異常活化的途徑有：①正常情況下，雌激素與雌激素受體結(jié)合能抑制NF-κB 的表達(dá)，在去卵巢所致的OP 模型中，由于缺乏足夠的雌激素與雌激素受體結(jié)合導(dǎo)致NF-κB 的異常活化[5]；②OP時，T細(xì)胞和其他細(xì)胞高度表達(dá)炎癥細(xì)胞因子，能促進(jìn)成骨細(xì)胞中NF-κB 活化，活化的NF-κB 同時能促進(jìn)TNF-α、IL-6、IL-1 的轉(zhuǎn)錄，使其表達(dá)增加，NF-κB 與炎癥細(xì)胞因子形成一個循環(huán)放大的過程[6]。大量NF-κB 的活化，使骨形成受抑制，導(dǎo)致OP 發(fā)生。

3.3 中醫(yī)不同治法對骨質(zhì)疏松癥大鼠骨骼、骨骼肌IкBα含量影響的比較研究

從本實(shí)驗(yàn)結(jié)果來看，與模型組比較，經(jīng)中醫(yī)不同治法治療的骨質(zhì)疏松癥大鼠骨骼的IкBα含量明顯升高，其中補(bǔ)腎組升高程度比較明顯，其次為健脾組；說明補(bǔ)腎和健脾方法，通過提高骨骼的IкBα含量可以抑制NF-κB 異常活化，減緩成骨細(xì)胞的凋亡過程，使骨形成多于骨吸收，有效的防治骨質(zhì)疏松癥。經(jīng)中醫(yī)不同治法治療的骨質(zhì)疏松癥大鼠骨骼肌的IкBα含量雖然與與模型組比較無統(tǒng)計學(xué)意義，但可以看到補(bǔ)腎組和健脾組有升高的趨勢，說明補(bǔ)腎和健脾方法，通過提高骨骼肌的IкBα含量可以抑制NF-κB 表達(dá)，從而提高肌肉的能量。

從上述結(jié)果來看，補(bǔ)腎和健脾方法，通過提高骨骼、骨骼肌的IкBα含量，提高骨骼和肌肉的協(xié)調(diào)性，從而有效的防治骨質(zhì)疏松癥，說明提示補(bǔ)腎方法是臨床治療骨質(zhì)疏松癥的根本方法。健脾方法是輔助補(bǔ)腎方法治療骨質(zhì)疏松癥的一個重要治法。