經方青娥丸對去勢大鼠骨質疏松作用機制的實驗研究

王曉燕 常時新 李冠武 周自明 袁軍 王樂 宋彥穎 繆宇

1.上海中醫藥大學附屬岳陽中西醫結合醫院，上海 200437 2.中國中醫科學院廣安門醫院，北京 100053

骨質疏松癥(Osteoporosis,OP)是以骨量降低和骨結構退化為特點，導致骨脆性和骨折風險增加的一種全身性、代謝性骨骼疾病[1]，往往引起脊柱骨和髖骨骨折，具有“四高一低”的特點，即高發病率、高致殘率、高病死率、醫療費用消耗高及低生活質量。原發性骨質疏松癥主要發生在老年人群中，中老年女性最為常見，尤其是絕經后婦女。本研究選擇SD雌性大鼠為研究對象，采用卵巢切除術建立絕經后骨質疏松模型，觀察補腎生髓經典方劑青娥丸治療絕經后骨質疏松癥可能的作用機制。

1 材料和方法

1.1 動物

6月齡SPF級雌性SD大鼠60只，體重350±15 g，購置于上海斯萊克實驗動物有限公司，飼養于上海中醫藥大學附屬岳陽中西醫結合醫院動物實驗中心(合格證：SYXK(滬)2006-0001，NO.0069937)。飼養觀察室溫度：21±2℃，相對濕度：45%-55%，給予標準光照周期(12 h光照/12 h黑夜)。

1.2 分組

將60只SD雌性大鼠根據隨機數字法分為4組，即假手術組(SHAM，n=15)，去勢對照組(OVX，n=15)，去勢青娥丸組(QEW，n=15)、去勢雌激素組(E2，n=15)。

1.3 造模

采用卵巢切除術建立絕經后骨質疏松模型：適應環境1周后，采用戊巴比妥鈉(劑量為30 mg/kg)腹腔注射麻醉動物。麻醉穩妥后，將動物仰臥位固定于手術臺上，電動剃毛器將下腹部剃毛，手術區域皮膚消毒，保持無菌操作。正中部位打開腹腔，撥開腸管找到卵巢，輸卵管遠端用血管鉗固定、結扎，將子宮闊韌帶分離，摘除雙側卵巢，將小腸等腹腔器官組織復位，關閉腹腔、對手術切口進行縫合,假手術組只需切除卵巢周圍等量脂肪組織即可[2]。

術后即刻予以肌注40萬U/kg青霉素，連續5天，每天2次，預防傷口感染。給予12 h光照/12 h黑暗循環，標準鼠籠分籠飼養，自由進食、進水。所有實驗鼠術前及術后均稱體重。術后密切觀察，注意傷口感染征象。

1.4 給藥

建模8周后，各組分別進行藥物干預。青娥丸組：青娥丸(杜仲、補骨脂、核桃仁、大蒜)，按照9 g/kg臨床劑量，根據動物間體表面積折算的等效劑量換算，予56.7 g/kg，每天灌胃兩次；雌激素組：給予β-雌二醇0.2 mL/kg藥物干預；正常組、假手術組及OVX對照組分別給予等量去離子水。根據每周體重調整藥物劑量，共給藥12周。動物處死前第14天和第13天皮下注射鹽酸四環素、處死前第4天、第3天皮下注射鈣黃綠素，進行骨熒光雙標記。

1.5 取材

藥物干預結束后，次日腹主動脈取血后處死所有動物，剝離脛骨及腰椎，儲存于-80 ℃冰箱備用。

1.6 指標檢測

1.6.1骨密度檢測

雙能X線吸收測量儀(dual X-ray absorptionmetry, DXA；Prodigy Lunar, GE Health-care, USA)采用專用動物成像軟件(Software Version enCORE 13.40.038)，對實驗鼠行全身骨密度掃描，以獲取腰椎(L3-L6)和股骨近端感興趣區骨密度，掃描條件：電壓76 kV，電流0.15 mA，掃描時間約4 min，掃描前首先進行質量保證測試，校準標準塊由廠家提供，研究期間其測量結果波動在DXA的質控Shewhart圖范圍內，BMD測量的精確性用變異系數(Coefficient of variation,CV)表示，CV均為0.98%[3]。

1.6.2骨組織形態計量學參數測定

每組動物隨機選取8只，于處死前的13 d、14d 和3 d、、4d 分別皮下注射鈣黃綠素(8 mg/kg)和鹽酸四環素(50 mg/kg)。處死動物后選取脛骨于70%無水乙醇 4℃保存，90%無水乙醇，4天每天換液1次，4℃保存，100%無水乙醇，4天每天換液1次，室溫保存，100%無水乙醇，5天每天換液1次，室溫真空保存，二甲苯，5天每天換液1次，室溫真空保存，二甲苯：UMMA 1∶1，5天每天換液1次，4℃真空保存，UMMA，5天每天換液1次，4℃真空保存，PMMA，待凝固包埋完成(注：使用PMMA包埋時需抽真空，使組織間空氣充分去除，補充流失PMMA)，5 μm和10 μm縱向不脫鈣骨切片，5 μm切片常規脫蠟至水后甲苯胺染色；10 μm切片用于熒光顯微鏡下觀察。然后利用骨組織形態學測量系統進行指標檢測，測量指標有：骨小梁體積百分比(TBV%)、骨小梁吸收表面百分比(TRS%)、骨小梁形成表面百分比(TFS%)、活性生成表面百分比(AFS%)、骨小梁礦化率(MAR)、骨小梁骨生成率(BFR)、類骨質平均寬度(OSW)、骨皮質礦化率(mAR)。

1.6.3ELISA檢測血清BALP、CTX-1、E2表達情況

實驗前將試劑盒及待測標本放置室溫平衡30 min，將標準品和樣本各100 μL依次加入孔中，并做好標記，在標準品和樣本孔中分別加入50 μL酶聯親和物，充分混勻。37℃溫育60 min后棄盡孔內液體，用稀釋好的洗滌液反復沖洗5次并扣干孔內剩余液體，每孔按照次序，分別加入顯色液，并充分混勻，在室溫下避光反應15 min，反應后每孔加入終止液50 μL，充分混勻，終止反應，用酶標儀在450 nm測定OD值。以標準品濃度作為橫坐標，OD值作為縱坐標，繪制標準曲線，得出標準方程，根據標準方程計算出每個樣本的濃度。

1.6.4統計學處理

采用SPSS 18.0 統計軟件進行統計學分析。計量資料以均數±標準差表示，兩兩比較采用t檢驗，符合正態分布和方差齊性采用單因素方差分析(one-way ANOVA)，如不符合正態分布和方差齊性則采用Kruslal-Wallis H檢驗。P<0.05被認為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 治療前后骨密度值比較

治療前各組實驗鼠股骨和椎骨骨密度值差異無統計學意義(P>0.05)，具有可比性，見表1。與治療前比較，OVX組股骨骨密度值顯著降低(P<0.01)，椎骨骨密度值也明顯降低(P<0.05)，表示造模成功；E2組治療后股骨和椎骨骨密度值較治療前均有明顯升高(P<0.05)；與治療前比較，QEW組治療后股骨和椎骨骨密度值也均有一定程度升高，但差異無統計學意義(P>0.05)。

部位Location組別Group治療前Before treatment治療后After treatment股骨Femur(g/cm2)椎骨Vertebra(g/cm2)Sham(n=8)0.13±0.00 0.13±0.01OVX(n=8)0.12±0.000.08±0.01??E2(n=8)0.12±0.010.13±0.00?QEW(n=8)0.12±0.01 0.13±0.02Sham(n=8)0.16±0.02 0.17±0.02OVX(n=8)0.15±0.010.12±0.03?E2(n=8)0.16±0.01 0.17±0.01?QEW(n=8)0.16±0.010.18±0.02

注：各組治療前后比較，*P<0.05，**P<0.01
Before and after treatment in each group,*P<0.05，**P<0.01

2.2 骨組織形態計量學參數比較

(1)骨小梁組織形態計量見表2，圖1。

組別nTBV(%)TRS(%)TFS(%)MAR(μm/d)Sham823.11±0.584.51±0.224.79±0.431.50±0.14OVX818.35±0.487.19±0.447.73±0.192.44±0.18E2821.67±0.885.91±0.186.18±0.091.68±0.22QEW822.39±0.496.72±0.296.88±0.352.03±0.19

圖1 骨小梁組織形態計量Fig.1 Trabecular bone histomorphometry注：*P<0.01，OVX vs.SHAM；#P<0.01，E2 vs.OVX，□P<0.05，E2 vs.SHAM，■P<0.01，E2 vs.SHAM；△P<0.05，QEW vs.OVX，▲P<0.01，QEW vs.OVX，◇P<0.05，QEW vs.SHAM，◆P<0.01，QEW vs.SHAM

采用Qwin V3圖像系統進行骨組織形態計量學數據分析，見表3，圖3。結果顯示：OVX組大鼠脛骨TBV%顯著低于SHAM組(P<0.05)；與OVX組比較，QEW組、E2組TBV%均顯著升高(P<0.05)，但二組均明顯低于SHAM組。OVX組大鼠脛骨TRS%顯著高于SHAM組(P<0.05)；與OVX組比較，QEW組、E2組TRS%均顯著降低(P<0.05)，但二組均明顯高于SHAM組。OVX組大鼠脛骨TFS%和MAR均顯著高于SHAM組(P<0.05)；與OVX組比較，QEW組、E2組TFS%和MAR均顯著降低(P<0.05)，與SHAM組比較，二組TFS%均明顯高于SHAM組，而QEW組MAR顯著增高(P<0.05)，E2組則差異無統計學意義(P>0.05)。(見圖1)

(2)皮質內表面形態計量

組別nOSW(μm)mAR(μm/d)Sham82.28±0.092.79±0.13OVX83.28±0.194.33±0.26E282.54±0.223.22±0.15QEW82.62±0.512.87±0.57

圖2 皮質內表面形態計量Fig.2 Cortical surface morphology measurement注：*P<0.01，OVX vs.SHAM；#P<0.01，E2 vs.OVX，■P<0.01，E2 vs.SHAM；▲P<0.01，QEW vs.OVX

同樣，采用Qwin V3圖像系統進行骨組織形態計量學數據分析，結果顯示：

OVX組大鼠脛骨OSW和mAR均顯著高于SHAM組(P<0.05)；與OVX組比較，QEW組、E2組mAR和OSW均顯著降低(P<0.05)，與SHAM組比較，E2組mAR和OSW均顯著增高(P<0.05)，而QEW組則差異無統計學意義(P>0.05)。(見圖2)

2.3 血清骨代謝及雌激素(BALP、CTX、E2)水平見表4-6，圖3-5

表4 各組大鼠血清中BALP水平Table 4 The levels of BALP in serum of each group

圖3 各組動物血清中BALP水平Fig.3 The levels of BALP in serum of each group注：*P<0.05，vs.SHAM；#P<0.05,vs.OVX

表5 各組大鼠血清中CTX水平Table 5 The levels of CTX in serum of each group

圖4 各組動物血清中CTX水平Fig.4 The levels of CTX in serum of each group注：*P<0.01，vs.SHAM；#P<0.01,▲P<0.05 vs.OVX；◆P<0.01,vs.E2

表6 各組大鼠血清中Estradiol水平Table 6 The levels of Estradiol in serum of each group

圖5 各組動物血清中Estradiol水平Fig.5 The levels of Estradiol in serum of each group注：*P<0.05，vs.SHAM；#P<0.01,▲P<0.05，vs.OVX；◆P<0.01,vs.E2

綜上，與SHAM組比較，OVX組BALP水平顯著降低，具有統計學意義；與OVX組比較，E2組和QEW組BALP水平均顯著升高，具有統計學意義。與SHAM組比較，OVX組CTX水平顯著增高，具有統計學意義；與OVX組比較，E2組和QEW組CTX水平均顯著降低，具有統計學意義；QEW組CTX水平顯著高于E2組，且具有明顯統計學差異。與SHAM組比較，OVX組雌激素水平顯著降低，具有統計學意義；與OVX組比較，E2組和QEW組雌激素水平均顯著升高，具有統計學意義；QEW組雌激素水平顯著低于E2組，且具有明顯統計學差異。

3 討論與分析

傳統中醫學并沒有對絕經后骨質疏松癥明確的相關記載，但根據該病的臨床癥狀及體征，可將其歸為“痹癥”“骨痹”“骨枯”“骨痿”等范疇，其中“骨痿”與之最為相似[4]。如《素問·痿論》云：“腎氣熱，則腰脊不舉，骨枯而髓減，發為骨痿。”明確指出，“骨枯而髓減”為骨痿的基本發病病機。《素問·上古天真論》曰：“女子七歲，腎氣盛，齒更發長；......七七任脈虛，太沖脈衰少，天癸竭，地道不通，故形壞而無子也”，《素問·痿論》又云：“腰者腎之府，轉搖不能，腎將憊矣”。可見絕經后女性腎氣虛弱，天癸枯竭，精虧髓減，髓不養骨，而致筋骨枯弱。因此，我們擬以補腎生髓經典方劑青娥丸以補腎強骨填髓治療絕經后骨痿。

青娥丸出自《太平惠民和劑局方》，為補腎強骨經典方劑。該方由杜仲、補骨脂、核桃仁組成，加大蒜熬膏，制為丸藥，具有良好的補腎、強骨、止痛之效。方中杜仲味甘性溫，歸肝腎經，《神農本草經》：“主腰脊痛，補中，益精氣，堅筋骨”，具有補肝腎、強健骨之效，用以治療腎虛腰痛及各種腰痛，可達強腰固本之功用，常與補骨脂配伍使用。補骨脂，味苦、辛，性溫，歸腎、脾經，具有補腎壯陽、固精縮尿、溫脾止瀉等功效，《本草經疏》：“補骨脂，能暖水臟，陰中生陽，壯火益士之要藥也”，善壯腎陽而暖水臟，以治療腎陽虛證為主，可治腎陽虛弱，風寒侵襲之腰膝冷痛。核桃仁，味甘，性溫，歸腎、肺、大腸經，具有補腎溫肺，潤腸通便之效，可治腰膝酸痛、下肢痿弱，因其溫補腎陽力弱，多與他藥配伍使用。大蒜，味辛，性溫，歸脾胃、肺經，可解毒消腫。全方共奏補腎強骨生髓之效。

骨密度是量化骨強度的良好指標，但是骨密度并不能精確的計算骨質量[5]。骨組織形態計量學是采用不脫鈣硬包埋法和活體熒光標記法制作骨組織標本，得到骨結構和骨重建參數，進而形象而直觀地量化和分析松質骨骨微結構，是評價骨轉換和骨微結構的重要方法，在骨代謝研究領域中具有重要的應用價值[6]。本課題研究發現：OVX組大鼠脛骨TBV%顯著低于SHAM組；與OVX組比較，QEW組、E2組TBV%均顯著升高，但二組均明顯低于SHAM組；OVX組大鼠脛骨TRS%、TFS%、MAR、OSW和mAR均顯著高于SHAM組；與OVX組比較，QEW組、E2組TRS%、TFS%、MAR、mAR和OSW均顯著降低，與SHAM組比較，兩組TBV%、TFS%均明顯高于SHAM組，E2組mAR和OSW均顯著增高，QEW組MAR顯著增高。脛骨TBV%是骨量水平高低的主要標志，TRS%代表骨吸收，而TFS%、MAR、OSW和mAR則是代表骨形成的主要參數，以上結果表明，QEW均能夠提高去勢大鼠骨量水平，且能夠在一定程度上調節骨轉換，對絕經后骨質疏松癥具有明顯的防治作用。

骨轉換標志物是評估骨代謝的生化指標[7]，能夠反映藥物對骨轉換的代謝作用，骨轉換增加是絕經后骨質疏松病理生理發展過程中最重要的因素。不同的標志物分別介導骨形成和骨吸收，而二者之間的不平衡通常被認為是導致骨質疏松的重要發病機制。本研究發現：E2組和QEW組BALP水平較OVX組均顯著升高，CTX水平較OVX組均顯著降低；QEW組CTX水平顯著高于E2組，且具有明顯統計學差異。青娥丸能夠使骨轉換速率下降，具有預防骨量丟失的作用。

由于雌激素水平的下降，大多數骨質疏松癥患者為絕經后女性。女性與年齡相關的骨流失分為兩個階段：第一個階段始于絕經，主要表現在骨小梁上，由于雌激素缺乏引起，并導致與骨形成相比骨吸收不成比例的增加，4-8年后該階段達到頂峰；第二階段開始，表現為骨小梁和骨皮質持久的、緩慢的損耗，主要是由骨形成下降引起的。研究結果顯示：E2組和QEW組雌激素水平較OVX組均顯著升高，而QEW組雌激素水平顯著低于E2組，且具有明顯統計學差異。研究結果表明，青娥丸可能具有植物雌激素樣作用，能夠改善雌激素缺乏所致的骨衰敗。

綜上所述，青娥丸治療腎虛型絕經后骨質疏松癥，可能與其能夠改善骨微結構，調節骨代謝、雌激素樣作用等機制相關。