拓撲異構酶2α受抑癌基因p53的調控并調節前列腺癌細胞的增殖能力

梁婷婷，王永坤，王 堯

(1.吉林大學第一醫院 腫瘤中心，吉林 長春130021；2.吉林大學中日聯誼醫院 a骨科；b泌尿外科)

拓撲異構酶2α受抑癌基因p53的調控并調節前列腺癌細胞的增殖能力

梁婷婷1，王永坤2a，王 堯2b*

(1.吉林大學第一醫院 腫瘤中心，吉林 長春130021；2.吉林大學中日聯誼醫院 a骨科；b泌尿外科)

目的 觀察TOP2α對前列腺癌細胞增殖能力的影響以及抑癌基因p53對TOP2α的調控能力。方法 以Lipofectamine2000試劑轉染針對p53和非特異性對照組的siRNA，干擾前列腺癌細胞C4-2中p53 的表達，采用Real-time PCR和Western Blot檢測細胞內TOP2α的mRNA和蛋白水平表達變化；采用質粒轉染法在293T細胞中過表達p53后檢測TOP2α蛋白水平的變化，明確p53對TOP2α表達的影響；采用BrdU標記法計算并檢測干擾或過表達TOP2α表達后對前列腺癌細胞增殖能力的影響，明確TOP2α對前列腺癌細胞增殖的調節能力。結果 干擾p53表達后細胞內TOP2α mRNA的表達明顯升高，說明p53可以調節TOP2α的轉錄水平，進一步檢測干擾p53表達后，TOP2α的蛋白水平表達明顯升高；在細胞內，過表達p53后檢測TOP2α的蛋白表達水平明顯下降；在C4-2細胞中干擾目標基因TOP2α的表達后，增殖細胞的百分比從(21.54±1.443)%下降至(13.78±0.4736)%(P<0.05)。同時，在C4-2細胞中過表達TOP2α后，增殖細胞的百分比從(20.84±2.082%)上升至(33.36±3.244)% (P<0.05)。結論 在前列腺癌細胞中，p53可以在mRNA和蛋白水平調節TOP2α的表達，TOP2α具有調節前列腺癌細胞增殖的能力。

腫瘤；前列腺癌；p53；TOP2α

(ChinJLabDiagn,2017,21:1261)

DNA拓撲異構酶2α(TOP2α)在細胞DNA復制和轉錄過程中維持染色體的空間結構具有重要的作用。研究表明，TOP2α可能參與調控了癌癥細胞的凋亡和增殖，其與肺非小細胞肺癌的腦轉移可能呈相關性，TOP2α的表達升高可以預測乳腺癌患者對于表阿霉素為主化療方案的反應性等[1]。TOP2α可能在前列腺癌的發展過程中發揮重要的作用，高表達TOP2α的前列腺癌細胞表現出更強的侵襲性和增殖能力[2]，但其在前列腺癌細胞內的具體作用機制尚不清楚。

p53是一個重要的抑癌基因，其在調控細胞的增殖、凋亡、DNA損傷修復等方面發揮了重要的作用[3]。超過70%的晚期前列腺癌患者的組織標本中出現p53基因的表達缺失[4]。p53是一個重要的轉錄因子，調控大量下游基因的表達進而發揮生物學作用，其在前列腺癌細胞中調控的重要效應因子是目前的研究熱點之一。本研究旨在檢測前列腺癌細胞中p53的表達和TOP2α表達的關系，以及TOP2α在前列腺癌細胞中的生物學作用。

1 材料與方法

1.1 細胞培養

前列腺癌細胞系C4-2用含有10%牛胎血清、100 U/ml青霉素和100 mg/L鏈霉素的RPMI-1640培養基，293T細胞用含有上述抗生素的DEME培養基，在37℃、5%CO2的培養箱中培養。

1.2 RNA干擾目標基因的表達

C4-2細胞在六孔板中均勻鋪板，24h后按照Lipofectamine2000試劑(購自美國Invitrogen公司)說明書進行干擾實驗，對照組(siCont)和實驗組siRNA劑量均為100pmol。對照組和TOP2α的siRNA購自Santa Cruz公司(sc-36695)，p53 siRNA購自IDT公司，序列為:5-AGUGUUUCUGUCAUCCAAAUACUCCAC。

1.3 細胞轉染實驗

293T細胞鋪板生長24 h后，按照PolyJet轉染試劑(購自SignaGen公司)說明書轉染目標質粒48 h，收集細胞并進行后續試驗。

1.4 Western blot實驗

收集細胞后進行裂解并檢測蛋白濃度，制備成1 mg/L的蛋白樣品。取適量樣品加入聚丙烯酰胺凝膠中進行電泳分離，轉膜后，5%脫脂牛奶封閉30 mins，4℃一抗孵育過夜，PBST沖洗10 min×3次，室溫下二抗孵育2 h，PBST沖洗10 min×3次，加入化學發光試劑(ECL)發光液后，暗室顯影并洗片保存。 P53抗體購自Santa Cruz公司(sc-6243),TOP2α抗體購自Santa Cruz公司(sc165986)。

1.5 BrdU標記法檢測細胞增殖能力

C4-2細胞鋪板于24孔板，RNA干擾實驗干擾目標基因表達后48 h。加入10 μmol/L BrdU孵育2 h，-20℃下Carnoy’s固定液固定20 min，加入2 mol/L HCl和0.1 mol/L Boric酸性液后，3%過氧化氫處理10 min，10%山羊血清封閉1 h，4℃ BrdU一抗(購自Sigma公司，B2531)孵育過夜，37℃ 二抗(購自Life Technologies公司，A10521)孵育1 h。SYTOX Green(購自Life Technologies公司， S7020)染色20min。熒光顯微鏡下觀察并計數。

1.6 統計學分析

2 結果

2.1p53調控了TOP2α在前列腺癌細胞中轉錄水平的表達

在前列腺細胞C4-2中干擾p53的表達后，利用Real-timePCR技術檢測TOP2α的表達變化，可見TOP2α的表達明顯升高(P<0.05)。說明p53可以抑制TOP2α在轉錄水平的表達。

2.2p53調控了TOP2α在前列腺癌細胞中蛋白水平的表達

在前列腺細胞C4-2中干擾p53的表達后，利用WesternBlot檢測TOP2α在蛋白水平的表達變化，可見TOP2α的表達明顯升高。說明p53可以抑制TOP2α在蛋白水平的表達，見圖1。

2.3 在293T細胞中過表達p53可以抑制TOP2α的蛋白表達

在293T細胞中，轉入2.0μgGFP-p53后，利用WesternBlot檢測TOP2α在細胞中的表達變化，發現TOP2α的表達明顯受到抑制。說明p53的過表達可以抑制細胞中TOP2α的表達。本實驗中同時轉入0.5μgmyc-空載體作為表達對照。

2.4TOP2α調控了前列腺癌細胞C4-2的增殖能力

在C4-2細胞中干擾目標基因TOP2α的表達后，檢測到增殖細胞的百分比從(21.54±1.443)%下降至(13.78±0.4736)%(P<0.05)。同時，在C4-2細胞中過表達GFP-TOP2α的表達后，檢測到增殖細胞的百分比從(20.84±2.082%)上升至(33.36±3.244)% (P<0.05)。說明，TOP2α具有調控前列腺癌細胞增殖能力的功能，見圖2。

3 討論

前列腺癌嚴重威脅男性的生殖健康[5]。隨著普查力度的提高，在我國前列腺癌發病率的提升引人矚目。前列腺癌發病隱匿，常常無癥狀，在沒有大范圍普查的情況下，我國超過60%患者診斷為前列腺癌時已經進入癌癥的中晚期，治療手段少并且常伴隨癌癥的轉移[6]。盡管近些年來，對于前列腺癌的系統治療進展迅速，放療、化療包括手術治療等方式一定程度緩解了患者疾病的進展程度，但總體治療效果依然有限[7]。

TOP2α在很多生物學過程中發揮重要的作用，例如DNA的復制、轉錄、修復和染色體的結構維持與重建[8]。體外實驗顯示在細胞復制過程中TOP2α常高表達，可以作為增殖性標志物之一[9]。

A：在前列腺癌細胞C4-2中干擾p53的表達后，TOP2α的mRNA水平表達明顯上調(與對照組比較，*，P<0.05)； B：在前列腺癌細胞C4-2中干擾p53的表達后，TOP2α在蛋白水平的表達明顯上調；C：在293T細胞中，通過質粒轉染過表達p53后，TOP2α的表達明顯降低；

圖1 在前列腺癌細胞中，p53在mRNA和蛋白水平調節了TOP2α的表達

A：在前列腺癌細胞C4-2中，過表達TOP2α后，檢測到細胞的增殖能力明顯升高(與對照組比較，*,P<0.05) B:干擾目標基因TOP2α的表達后，檢測到細胞的增殖能力明顯降低(與對照組比較，*,P<0.05)

圖2 TOP2α調節前列腺癌細胞的增殖能力

TOP2α表達的異常經常和染色體結構不穩定相關[8]。有報道認為TOP2α的高表達可能和細胞的侵襲性相關并發現其在多種惡性腫瘤中表達增高，包括前列腺癌，TOP2α的表達水平和前列腺癌的Gleason評分呈正相關[10]。

p53是一個重要的抑癌基因和轉錄因子，在多種腫瘤內出現功能缺失[11]，超過70%的晚期前列腺癌出現p53 的功能缺失，但其發揮的重要作用尚不清楚。作為轉錄因子，p53可以調控多種基因的表達。前期研究發現，p53的缺失可以誘導前列腺內PIN的發生(一種癌前病變)，以上研究結果說明p53可能調控了前列腺癌細胞的增殖能力并促進了前列腺癌的發生與發展。本研究結果顯示p53可以在mRNA和蛋白水平調控TOP2α在前列腺癌細胞中的表達，說明TOP2α可能是p53所調控的下游蛋白之一。

本研究結果表明，在前列腺癌細胞C4-2中干擾p53的表達，TOP2α在mRNA和蛋白水平表達會明顯升高，過表達p53后細胞內的TOP2α蛋白表達會明顯減弱，TOP2α是p53所調控的下游基因之一。同時，干擾TOP2α的表達后增殖的前列腺癌細胞明顯減少，而過表達TOP2α后增殖細胞的數量明顯增強，說明，TOP2α在前列腺癌細胞中可以調控細胞的增殖能力。本研究結果表明，p53可能通過調節目標基因TOP2α在前列腺癌細胞中的表達調控了細胞的增殖。

[1]Schaefer-Klein JL,Murphy SJ,Johnson SH,et al.Topoisomerase 2 Alpha Cooperates with Androgen Receptor to Contribute to Prostate Cancer Progression[J].PLoS One,2015,10(11):e0142327.

[2]Hughes C,Murphy A,Martin C,et al.Topoisomerase II-alpha expression increases with increasing Gleason score and with hormone insensitivity in prostate carcinoma[J].J Clin Pathol,2006,59(7):721.

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[4]Karanika S,Karantanos T,Li L,et al.DNA damage response and prostate cancer:defects,regulation and therapeutic implications[J].Oncogene,2015,34(22):2815.

[5]Roubaud G,Liaw BC,Oh WK,et al.Strategies to avoid treatment-induced lineage crisis in advanced prostate cancer[J].Nat Rev Clin Oncol,2017,14(5):269.

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[9]Wang TL,Ren YW,Wang HT,et al.Association of Topoisomerase II (TOP2A) and Dual-Specificity Phosphatase 6 (DUSP6) Single Nucleotide Polymorphisms with Radiation Treatment Response and Prognosis of Lung Cancer in Han Chinese[J].Med Sci Monit,2017,23:984.

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TOP2α，a novel p53 target gene,regulates proliferation of prostate cancer cells

LIANGTing-ting，WANGYong-kun,WANGYao.

(CancerCenter,TheFirstClinicalHospitalofJilinUniversity,Changchun130021,China)

Objective To investigate whether Topoisomerase (DNA) II alpha (TOP2α) promote prostate cancer cells proliferation and regulated by p53.Methods After inhibiting expression of p53 by interfering RNA (RNAi) in C4-2 cells using Lipofectamine2000,the mRNA and protein expression level were assessed by Real-time PCR and Western Blot.After transfecting GFP-p53 in 293T cells by according to the manufacturer’s instruction,the expression level of TOP2α was assessed by Western Blot.After knockdown TOP2α by RNAi in C4-2 cells,proliferation was tested by Bromodeoxyuridine incorporation assay (BrdU).Then,the BrdU assay was repeated after transfecting GFP-TOP2α.Results The mRNA and protein level were significant increased after transfection of siRNA against p53.Moreover,proliferation was further decreased from (21.54±1.443)% to(13.78±0.4736)% (P<0.05).At the meantime,after transfectiong GFP-TOP2α,proliferation was further increased from (20.84±2.082%)to(33.36±3.244)% (P<0.05).Conclusion Our findings suggest that p53 regulates the mRNA and protein level of TOP2α,and TOP2α could regulates proliferation ability of C4-2 cells.

Cancer；Prostate Cancer；p53；TOP2α

國家自然科學基金(81241027)

1007-4287(2017)07-1261-04

R737.25

A

2017-03-26)

*通訊作者