六味地黃丸對絕經(jīng)期腎陰虛骨質(zhì)疏松癥的基因表達調(diào)控數(shù)據(jù)分析

盧嚴(yán)方 林貫川 劉倩倩 劉夢宜 馬文麗 潘星華

南方醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，廣東 廣州 510515

六味地黃丸是宋代錢乙創(chuàng)制的滋陰補腎的方劑，由熟地黃、酒萸肉、牡丹皮、山藥、茯苓、澤瀉組成，為補益劑，具有滋陰補腎之功效。現(xiàn)代藥理研究也已證實六味地黃方劑具有治療骨質(zhì)疏松、增強免疫功能、抵抗衰老病癥及其他功效[1-2]。

隨著中藥現(xiàn)代化的不斷推進和基因芯片的廣泛應(yīng)用，在中醫(yī)藥治療疾病方面產(chǎn)生了大量的基因芯片數(shù)據(jù)，然而由于數(shù)據(jù)分析技術(shù)的局限性，大量的數(shù)據(jù)并沒有得到充分的利用，因此本研究針對美國國家生物信息中心(National Center for Biotechnology Information，NCBI)上六味地黃丸治療骨質(zhì)疏松癥方面的功效相關(guān)數(shù)據(jù)集進行基因表達譜差異及其相關(guān)功能機制的分析。

1 材料與方法

1.1 GEO數(shù)據(jù)集

本研究所采用的與六味地黃丸相關(guān)的基因表達譜數(shù)據(jù)(登錄號為GSE57273)，是從NCBI數(shù)據(jù)庫GEO(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/)中下載，在GEO Series數(shù)據(jù)庫搜索框中以“Liuwei Dihuang Pill”為檢索詞，獲得由Xie等人提交的芯片數(shù)據(jù)GSE57273。GSE57273所用的實驗平臺是Agilent公司的014850人類全基因組芯片4x44K G4112F(特征數(shù)版)，采取患者骨外周血進行芯片檢測，共有3例患者，6個樣本，其中六味地黃丸治療絕經(jīng)期腎陰虛骨質(zhì)疏松癥前樣本數(shù)為3個(對照組)，治療3個月后樣本數(shù)為3個(實驗組)。生物芯片檢測對組織樣本數(shù)的最低要求為3個，3個就已經(jīng)達到生物學(xué)重復(fù)，有統(tǒng)計學(xué)意義。此數(shù)據(jù)樣本病例的納入標(biāo)準(zhǔn)和排除標(biāo)準(zhǔn)以及合并用藥均有嚴(yán)格詳細的規(guī)范[3]。

1.2 分析工具

1.2.1數(shù)據(jù)處理和差異基因分析：Qlucore Omics Explorer3.0(http://www.qlucore.se/)可用于分析基因芯片、miRNA芯片、甲基化芯片和蛋白質(zhì)芯片，該軟件功能全面，操作簡便。本研究利用Qlucore Omics Explorer3.0軟件對芯片數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計學(xué)分析，先將數(shù)據(jù)集導(dǎo)入Qlucore Omics Explorer3.0軟件，進行標(biāo)準(zhǔn)化處理(平均數(shù)為0，標(biāo)準(zhǔn)差為1)，采用Two Group Comparsion(兩組樣本T檢驗)統(tǒng)計分析方法，對數(shù)據(jù)進行有效過濾，從而篩選出差異基因[4]。

1.2.2差異基因的GO富集分析和通路分析：生物學(xué)信息注釋數(shù)據(jù)庫(the database for annotation，visualization and integrated discovery，DAVID)為大規(guī)模的基因或蛋白列表提供系統(tǒng)綜合的生物功能注釋信息，能夠找出最顯著富集的生物學(xué)注釋。本研究是將篩選出的差異基因上傳至DAVID(https://david.ncifcrf.gov/)在線軟件，選擇DAVID軟件中的基因功能注釋聚類分析(Functional Annotation Clustering)，對這些差異基因進行生物學(xué)通路、分子功能、生物學(xué)過程預(yù)測分析[5-6]。

1.2.3差異基因編碼蛋白的相互作用分析：蛋白質(zhì)相互作用關(guān)系數(shù)據(jù)庫(functional protein association networks，STRING)，包含了來自2031種生物的9643763種蛋白質(zhì)，是最大的蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫之一，通過STRING在線分析工具，可以直接或間接地預(yù)測蛋白質(zhì)之間的關(guān)系。將差異基因?qū)隨TRING(http://string-db.org/)分析工具，分析其所編碼的蛋白質(zhì)之間的相互作用聯(lián)系圖，找出處在關(guān)鍵節(jié)點的蛋白質(zhì)[7-8]。

2 結(jié)果

2.1 六味地黃丸對絕經(jīng)期骨質(zhì)疏松癥治療前后的差異基因分析

通過QOE軟件導(dǎo)入GSE57273數(shù)據(jù)集進行主成分分析，在沒有經(jīng)過篩選處理之前，可以看到在動態(tài)PCA圖中顯示(見圖1)數(shù)據(jù)樣品之間的分布變異很大，表明數(shù)據(jù)集中的基因需要進行進一步的標(biāo)準(zhǔn)化處理。

圖1 GSE57273篩選前兩組原始動態(tài)PCA圖Fig.1 The picture of original dynamic PCA in two groups before GSE57273 screening

由圖1可以看到兩組數(shù)據(jù)分組，藍色為六味地黃丸治療絕經(jīng)期腎陰虛骨質(zhì)疏松癥前的樣品芯片數(shù)據(jù)，黃色為六味地黃丸治療絕經(jīng)期腎陰虛骨質(zhì)疏松癥之后的芯片數(shù)據(jù)。但是兩組數(shù)據(jù)相當(dāng)分散，變異較大，此時基因總變量為19136個基因。

隨后，對數(shù)據(jù)進行標(biāo)準(zhǔn)化處理，使mean=0，variance=1，然后篩選差異基因(如圖2)，此時不同樣品對之間變異縮小，六味地黃丸治療組和未治療組能夠完全分開并各自聚集。此時篩選條件為：P=1.4814e-5<0.05，F(xiàn)old Change=2，Q=0.003<0.01，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

圖2 GSE57273篩選后兩組的動態(tài)PCA圖Fig.2 The picture of original dynamic PCA in two groups after GSE57273 screening

由圖2可以看出，藍色點(治療前)和黃色點(治療后)已經(jīng)完全分開。表明六味地黃丸治療絕經(jīng)期腎陰虛骨質(zhì)疏松癥前后確實存在著基因差異。此時篩選出的差異基因有97個。

將這些篩選出的差異基因經(jīng)熱圖(見圖3)分析之后顯示出治療后上調(diào)基因有2個，分別是TNP1和MAP3K10，下調(diào)基因有95個。

圖3 篩選的差異基因熱圖Fig.3 The heat map of screened differential gene

2.2 差異基因的功能聚類(DAVID)分析

為了驗證篩選出的97個差異基因參與的主要生物學(xué)功能，筆者將97個差異基因?qū)氲紻AVID中得到如表1所示的基因功能富集類型。

2.3 差異基因蛋白質(zhì)相互關(guān)系網(wǎng)絡(luò)圖(STRING)分析

為了解97個差異基因所編碼蛋白質(zhì)相互關(guān)系的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，筆者把97個差異基因進行了STRING分析，其中STRING識別出的差異基因為88個，得到如圖4所示的蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)圖。

由圖4可以看出，在可識別的88個差異基因中，可以發(fā)現(xiàn)蛋白質(zhì)網(wǎng)絡(luò)圖中多數(shù)基因之間相互比較孤立，但是以XRN1為中心的ZNF家族基因(ZNF292、ZNF131、ZNF808、ZNF85、ZNF430、ZNF813、ZNF25、ZNF709、ZNF727)、XPO1、PPP1R8、LSM14A聯(lián)系密切(Connection score>0.400，表明所分析蛋白相互作用可信度在中等以上)。由差異基因表達熱圖(圖3)中可以發(fā)現(xiàn)在篩選出的差異基因中只有TNP1和MAP3K10兩個基因在經(jīng)過六味地黃丸治療后表達上調(diào)，其他基因則全部表達下調(diào)，表明這兩個基因在六味地黃丸治療絕經(jīng)期腎陰虛骨質(zhì)疏松癥中可能起著關(guān)鍵作用。經(jīng)過系列分析，筆者可以初步說明六味地黃丸影響絕經(jīng)期腎陰虛骨質(zhì)疏松癥治療作用的分子機制主要集中在這6個基因以及ZNF家族基因上。

表1 根據(jù)富集系數(shù)篩選出的六味地黃丸治療前后差異基因功能富集表Table 1 The function enrichment of screened differential genes before and after rehmanniae bolus treatment according to enrichment score

圖4 差異基因的蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)圖Fig.4 Differential genes in protein interaction networks

2.4 數(shù)據(jù)挖掘和分析

絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松腎陰虛證是目前老年婦女的常見病，嚴(yán)重影響著老年婦女的身體健康，其發(fā)病機理涉及到骨形成與吸收、激素合成、免疫調(diào)節(jié)、礦物質(zhì)吸收、鞘磷脂代謝、蛋白質(zhì)消化吸收等生物學(xué)過程。本文著重就六味地黃丸治療絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松腎陰虛證中的骨形成與吸收、激素合成、免疫調(diào)節(jié)3個方面生物學(xué)過程進行相關(guān)分子機制的探討。

2.4.1促進骨的形成：雌激素是女性最為重要的性激素之一，具有促進骨形成與抑制骨吸收的作用，對維持骨密度、提高骨量具有促進作用，絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松腎陰虛證的發(fā)生與骨形成的減少和骨吸收的增加密不可分[9]。采用六味地黃丸治療后，從差異基因的蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)路圖中可以發(fā)現(xiàn)，節(jié)點度最高的基因是XRN1基因，與其密切相關(guān)的則是ZNF家族基因(ZNF292、ZNF131、ZNF808、ZNF85、ZNF430、ZNF813、ZNF25、ZNF709、ZNF727)。ZNF家族基因在細胞中具有許多重要的功能，其最為重要的作用是轉(zhuǎn)錄調(diào)控。筆者發(fā)現(xiàn)經(jīng)篩選出的ZNF家族基因在六味地黃丸治療后全部都是低表達的，而ZNF131基因則是雌激素受體α(ERα)的抑制因子，并且是BTB/POZ轉(zhuǎn)錄因子家族的典型成員，它在細胞內(nèi)普遍表達并具有高度的序列保守性。研究表明ZNF131能夠阻止甚至阻斷ERα結(jié)合雌激素效應(yīng)元件(ERE)，另外ZNF131也能夠抑制ERα靶基因pS2的表達[10-13]。因此筆者推斷六味地黃丸治療絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥腎陰虛證的分子機制可能是通過降低ZNF131基因的表達，減少ZNF131對雌激素受體的抑制作用，從而增加雌激素和雌激素受體(ERα)的結(jié)合，使得成骨細胞活性增加，破骨細胞活性降低，促進骨的形成并抑制骨的吸收。同時，XRN1基因目前已被證實是抑制骨肉瘤的關(guān)鍵基因，而骨肉瘤產(chǎn)生的機制就是瘤細胞直接產(chǎn)生腫瘤骨或骨樣組織。由熱圖中可以看到XRN1基因在六味地黃丸治療之后是低表達的，因此筆者推測六味地黃丸治療絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥腎陰虛證在骨形成方面的另一分子機制是通過降低ZNF家族基因的表達來調(diào)控降低成骨細胞中XRN1基因的表達，從而使得成骨細胞更多的轉(zhuǎn)化為骨質(zhì)，達到緩解治療絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥腎陰虛證的作用[13]。

2.4.2促進雌激素與雌激素受體的結(jié)合：性激素能參與骨代謝，其中雄激素主要是間接合成蛋白質(zhì)，促進骨內(nèi)膠原形成，進而促使鈣、磷等在骨內(nèi)沉積。Schweik-ert等指出每個正常男性或女性的骨細胞內(nèi)含(821±140)個分子的雄激素受體，骨細胞中有雄激素受體(AR)基因轉(zhuǎn)錄的mRNA，并且能表達AR蛋白質(zhì)，證明雄激素對骨細胞的作用是直接的[14-15]。同樣，雌激素也能參與骨的代謝。女性絕經(jīng)后卵巢分泌雌激素功能減退，但卵巢間質(zhì)可分泌雄激素，雄激素在外周可通過芳香化酶的作用轉(zhuǎn)化為雌酮，成為此時血循環(huán)中的主要雌激素[16]。

在熱圖中可以看到所篩選出來的差異基因TNP1在治療后是高表達的(圖3)，由功能通路富集表可知TNP1參與廣泛的生物學(xué)過程(調(diào)控轉(zhuǎn)錄、調(diào)控核酸代謝、正調(diào)控分子功能、調(diào)控細胞內(nèi)信號通路以及調(diào)控細胞凋亡等)。研究表明TNP1基因與雌激素受體具有顯著的正相關(guān)性。因此六味地黃丸治療絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥腎陰虛證的另一分子機制可能是通過調(diào)控TNP1的表達來增強雌激素受體與雌激素的結(jié)合，進而增加雌激素的生物利用度治療絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松腎陰虛證[17-18]。

2.4.3增強免疫調(diào)節(jié)：骨免疫學(xué)認為免疫系統(tǒng)和免疫因素的調(diào)節(jié)對骨質(zhì)疏松的發(fā)展起著重要作用，同時免疫細胞和骨細胞間的對話也為揭示性激素和炎癥通過調(diào)節(jié)T淋巴細胞功能導(dǎo)致骨丟失機制創(chuàng)造了機遇[19-21]。最近人們認識到，T淋巴細胞可調(diào)節(jié)成骨細胞和破骨細胞的生成、代謝和活性，T細胞分泌的多種細胞因子可抑制成骨細胞的分化并抑制其凋亡，而性激素的老化和減少可影響免疫系統(tǒng)和T細胞；另外T細胞可能具有直接作用于破骨前體細胞從而誘導(dǎo)破骨細胞分化的能力[22]。絕經(jīng)后婦女卵巢功能減退，雌激素水平下降，促進T細胞的激活和增殖，引起體內(nèi)免疫應(yīng)答因子的變化，抑制成骨細胞的產(chǎn)生，促進破骨細胞的生成并抑制其凋亡，骨吸收超過骨形成，導(dǎo)致骨偶聯(lián)失衡，引發(fā)骨重建失衡，最終引起骨質(zhì)疏松癥的發(fā)生[23-25]。

另外，在篩選出來的差異基因中另一個高表達基因是MAP3K10，即絲裂原活化蛋白激酶10。MAP3K10基因參與廣泛的生物學(xué)過程，其中尤為重要的一點是參與調(diào)節(jié)細胞內(nèi)的核酸轉(zhuǎn)錄，能夠調(diào)節(jié)核酸代謝和細胞凋亡[26-27]。而在蛋白質(zhì)網(wǎng)絡(luò)圖中與XRN1基因聯(lián)系密切的XPO1基因則是參與細胞周期調(diào)控的基因，同時與XPO1基因聯(lián)系密切的NUP54基因是一個蛋白編碼基因，其相關(guān)通路與免疫系統(tǒng)密切相關(guān)[28-29]。因此六味地黃丸治療絕經(jīng)期腎陰虛骨質(zhì)疏松癥在免疫調(diào)節(jié)上的分子機制可能是通過上調(diào)MAP3K10基因的同時下調(diào)XPO1基因，進而使得NUP54基因表達降低，引起免疫應(yīng)答減弱，減少T細胞的活化，促進成骨細胞的生成，抑制破骨細胞的合成并促進其凋亡，達到治療絕經(jīng)期腎陰虛骨質(zhì)疏松癥的目的。

3 結(jié)論

六味地黃丸作為中成藥的代表之一，其對人體的功效正在被不斷地挖掘發(fā)現(xiàn)。本文針對六味地黃丸對絕經(jīng)期腎陰虛骨質(zhì)疏松癥的功效在基因?qū)用嫔献髁艘幌盗械臄?shù)據(jù)挖掘分析，旨在得到六味地黃丸治療骨質(zhì)疏松的相關(guān)靶基因和調(diào)控機制，分析結(jié)果顯示其在基因調(diào)控上主要是通過下調(diào)XRN1基因和ZNF家族基因的表達促進雌激素的分泌和上調(diào)MAP3K10基因的表達并下調(diào)XPO1基因和NUP54基因的表達來平衡免疫應(yīng)答從而促進骨組織的形成。另外，上調(diào)TNP1基因的表達促進雌激素與雌激素受體結(jié)合，提高雌激素的生物利用度，達到治療緩解絕經(jīng)期腎陰虛骨質(zhì)疏松癥的目的，本研究在分子層面上為今后骨質(zhì)疏松癥的臨床治療起到了一定的指導(dǎo)作用。