生酮飲食導致小鼠骨質疏松的顯微骨結構和生物力學研究

吳秀華 王曉萌 黃志平 劉俊豪 黃祖成 孔剛剛 朱青安

南方醫科大學南方醫院脊柱骨科，廣東 廣州 510515

生酮飲食(ketogenic diet，KD)是一種高脂肪、低碳水化合物的配方飲食，使機體產生酮體代謝，提高血液中β羥丁酸水平。生酮飲食時酮體成為主要的能量來源[1]，相對于糖代謝而言，酮體進入三羧酸循環代謝產生能量速度較快[2]，消耗同等量氧氣時，酮體產生的能量更多。1921年Wilder提出KD治療兒童癲癇[3-4]，目前在臨床上是兒童耐藥性癲癇的治療手段之一，也用于治療急性和退變性神經系統疾病。雖然國內外文獻報道KD總體上是安全和有效[5]，但其不良反應和對生長發育的影響也受到關注[6]。例如，有多個KD治療耐藥性癲癇不良反應的報道，出現腎結石、缺鐵性貧血、繼發性肉堿缺乏、心肌病、骨密度降低等[7]。盡管觀察到生酮飲食用于治療兒童耐用性癲癇時會引起骨質疏松，但還缺少相應的實驗研究。本文采用生酮飲食喂養成年C57雌性小鼠3個月，分析股骨遠端松質骨和中段皮質骨的顯微結構，以及測量脛骨三點彎曲的力學性能，評價生酮飲食導致的骨質疏松，為臨床上觀察生酮飲食對骨代謝的影響提供實驗依據。

1 材料與方法

1.1 動物模型與分組

10只8周齡雌性C57小鼠由南方醫科大學動物中心提供，體重16～18 g，隨機分為生酮飲食和正常飲食(SD)組，每組5只，喂養3個月。KD組給予“奇酮奶”喂養，SD組每天給予普通飼料喂養。每兩周通過剪尾法取血，測定血糖、血酮、體重。

SD組由南方醫科大學動物實驗中心提供的普通飼料喂養。KD組喂養由深圳捷利康公司生產的“奇酮奶”，其碳水化合物與脂肪的比例為1:4。“奇酮奶”已用于臨床上治療兒童耐藥性癲癇，其基本營養素含量詳見表1。喂養3個月后的小鼠在過量麻醉下處死。取小鼠雙側股骨和脛骨，股骨置于4%多聚甲醛中浸泡固定24 h，而脛骨新鮮地冷凍于-80 ℃冰箱中。

表1 普通飼料與生酮飲食成分Table 1 Components of normal and KD diets

1.2 骨微結構分析

對所有小鼠的右側股骨行顯微CT分析。右側股骨垂直放入顯微CT標本杯中，并用圓形泡沫柱穩妥固定，行顯微CT(μ80，Scanco公司，瑞士)掃描。預掃完畢后分別選擇股骨遠端1/3的部位和股骨中段180層作為感興趣區域，進行批量掃描。掃描參數設置為電壓55 kv，電流145 μA，層厚為12 μm。掃描完成后，從圖層中沒有股骨髁的層數開始選取100層，采用顯微CT自帶軟件進行松質骨顯微結構分析，測量骨體積分數(BV/TV)、骨小梁數目 (Tb.N)、骨小梁間隙(Tb.Sp)、骨小梁厚度(Tb.Th)、各向異性程度(DA)、結構模型指數(SMI)、骨小梁連接密度(Conn.D.)等。測量股骨中段的100層皮質骨的厚度(Ct.Th)、骨體積分數(BV/TV)、皮質骨骨密度(BMDBV)、皮質骨橫截面面積(Barea)。

1.3 脛骨三點彎曲測試

右側脛骨標本在室溫下解3 h后，采用電磁伺服材料試驗機(E1000，Instron公司，美國)對其進行三點彎曲實驗。具體方法如下：采用游標卡尺測量脛骨長度，以確定脛骨的中點；將脛骨放置于自制的三點彎曲支架上，支架的跨距為10 mm，兩端支架到脛骨中點的距離為5 mm，以1 mm/min的速度在脛骨中點向下橫向壓縮至破壞。連續記錄載荷和位移，從載荷-位移曲線中得到最大載荷、剛度、最大吸收能量。

1.4 股骨組織學

取左側股骨清水沖洗后用EDTA脫鈣4 w，針刺無阻力感后開始脫水，浸蠟，石蠟包埋。行縱向切片，厚度為4 μm。行HE染色，觀察股骨遠端骨小梁分布。

2 結果

2.1 小鼠的體重、血糖、血酮情況

KD組小鼠在2 w、4 w、6 w、8 w、10 w和12 w的體重分別為(18.3±1.3)g、(18.3±1.2)g、(21.3±1.2)g、(20.0±1.4)g、(21.3±1.2)g和(22.3±1.2)g，而SD組在各時間點的體重分別為(19.5±1.3)g、(19.8±0.5)g、(20.5±0.5)g、(22.5±0.5)g、(23.5±1.5)g和(23.5±0.5)g，兩組間體重在各個時間點的差異均無統計學意義。KD組在4 w、6 w、8 w、10 w和12 w的血糖水平分別為(13.6±2.1)mmol/L、(9.7±1.5)mmol/L、(14.5±1.9)mmol/L、(14.5±2.2)mmol/L和(11.5±1.8)mmol/L，SD組在各時間點分別為(8.6±1.2)mmol/L、(9.5±0.9)mmol/L、(12.1±1.6)mmol/L、(12.3±1.8)mmol/L和(12.5±2.1)mmol/L，兩組間血糖水平在各個時間點的差異均無統計學意義。KD組在2 w、4 w、6 w、8 w、10 w和12 w的酮體水平分別為(1.2±0.3)mmol/L、(0.9±0.2)mmol/L、(1.0±0.3)mmol/L、(0.8±0.1)mmol/L、 (0.9±0.2)mmol/L和(0.9±0.2)mmol/L，而SD組各時間點分別為(0.1±0.1)mmol/L、(0.1±0.1)mmol/L、(0.1±0.1) mmol/L、(0.5±0.2)mmol/L、(0.2±0.1)mmol/L和(0.2±0.1)mmol/L，兩組間血酮水平在各個時間點的差異均有統計學意義(P<0.05)(圖1)。

圖1 生酮飲食和正常飲食小鼠的體重、血糖、血酮水平Fig.1 Weight, blood glucose and blood ketone of mice in the SD and KD groups

2.2 股骨微結構

KD組股骨遠端松質骨的骨密度、骨體積分數、骨小梁厚度、連接密度均低于SD組，且骨小梁間隙變大，兩組間骨密度、骨體積分數、連接密度等的差異有統計學意義(P<0.05)(表2和圖2、3)。

兩組間股骨中段皮質骨骨密度、骨體積分數或皮質骨厚度的差異均無統計學意義(P>0.05)(表2)，而KD組皮質骨平均橫截面積顯著小于SD組(P<0.05)(圖2)。

表2 生酮飲食和正常飲食小鼠股骨遠端松質骨和中段皮質骨的結構參數Table 2 Structural parameters of cancellous bone at distal femur and cortical bone at middle femur in mice under the two diets

注：表內數值為平均值±標準差。每組小鼠數量為5只。*表示與SD組比較的差異有統計學意義(P<0.05)。

圖2 生酮飲食和正常飲食小鼠股骨遠端顯微CT重建和橫斷面圖像Fig.2 Micro-CT images of cancellous bone at distal femur in the two diet groups

圖3 生酮飲食和正常飲食小鼠股骨中段皮質骨顯微CT圖Fig.3 Micro-CT images of cortical bone at middle femur in the KD and SD diet groups

2.3 脛骨三點彎曲

與SD組相比較，KD組脛骨三點彎曲的最大力、最大橈度、剛度、最大吸收能量均有下降趨勢(表3)。兩組間最大力、剛度和最大吸收能量的差異有統計學意義(P<0.05)。

表3 小鼠脛骨三點彎曲實驗的力學參數Table 3 Mechanical parameters of the three-point bending test of tibia in mice

注：表內數值為平均值±標準差。每組小鼠數量為5只。*P<0.05。

2.4 股骨組織學

HE染色的組織學圖片也表明KD組股骨遠端骨小梁稀疏、數量減少，骨小梁間隙增大(圖4)。

圖4 生酮飲食和正常飲食小鼠股骨遠端HE染色的組織學圖像Fig.4 Histological images of distal femur by HE staining in KD and SD diet groups

3 討論

已證實生酮飲食在多種神經系統疾病中有神經保護作用，對于兒童耐藥性癲癇有治療作用，本文進一步研究其對骨代謝的影響。本研究發現生酮飲食弱化了小鼠股骨遠端松質骨的微結構，導致松質骨骨質疏松。本研究還發現生酮飲食盡管對皮質骨的微結構沒有影響，但減少了其幾何尺寸，導致皮質骨骨質疏松。從生物力學和組織學上證實了生酮飲食導致的骨結構的弱化和生物力學強度的降低。

生酮飲食是一種特殊的高脂飲食，其極低的碳水化合物含量使得機體從糖代謝轉為酮體代謝[8]。酮體代謝很容易受到破壞，少許的碳水化合物就可以使體內的酮體水平大幅度降低，且需要較長時間才能恢復。所以，生酮飲食有別于一般的高脂飲食，它導致了機體代謝的轉變，維持血糖水平正常，但高血酮水平[9]。多個研究證實高脂飲食弱化C57小鼠股骨松質骨骨結構[10-12]，導致的骨質疏松與去勢骨質疏松相似，但股骨中段皮質骨未發生明顯變化[13]。本文發現生酮飲食不僅弱化小鼠松質骨骨結構，而且減少了皮質骨橫截面積，弱化了生物力學性能。這可能是在酮體代謝下特有的現象，值得進一步的研究。因此，生酮飲食導致的骨質疏松可能不同于高脂飲食所導致的骨質疏松，這也為皮質骨的骨質疏松造模提供了一種方法。

本文在研究中觀察到生酮飲食6w的小鼠股骨松質骨和皮質骨均未發生明顯變化，說明短期的生酮飲食對骨代謝的影響不大。這提示在臨床上使用生酮飲食作為治療癲癇的手段時，要注意其對骨代謝所產生的不利影響。

有報道發現更高酮體水平對急性脊髓損傷的神經保護作用更為明顯[14]。本文采用的生酮飼料是臨床上用于治療兒童耐藥性癲癇的食品之一，其蛋白質和碳水化合物與脂肪比例為1∶4，可使小鼠的血酮水平達到1.0 mmol/L。今后還需要研究更高比例的生酮飲食對骨代謝的影響，確定骨代謝對酮體水平的依賴性。

總之，本文證實了生酮飲食對小鼠骨代謝的影響，不僅導致松質骨的骨質疏松，還導致皮質骨的弱化，提示需要進一步探討生酮飲食引起骨質疏松的機理，觀察生酮飲食對成骨細胞和破骨細胞的抑制或增殖作用，研究其作用的分子機制。