麝香對顱骨骨缺損模型大鼠SCF和MCP-1 mRNA表達的影響及意義

李應福 李寧* 謝興文 宋敏 徐世紅 蔣國鵬

1. 甘肅中醫藥大學，甘肅 蘭州 730000 2. 甘肅省中醫院，甘肅 蘭州 730050

近年來，隨著人們生活節奏的加快，骨折的發生率大大提高，繼之骨折后骨缺損的發生逐年呈現增高趨勢，如何使這種高能量、高速度、多復合傷損傷的愈合時間與愈合速度及治愈率顯著提升，減少愈合延遲、畸形愈合及不愈合的發生幾率，已經成為骨科領域一項長期面臨的挑戰與機遇[1-4]。目前大量研究表明，從分子生物學、細胞生物學及基因水平入手，通過中藥血清藥理學結合現代化檢測方法，研究單味中藥或中藥復方治療疾病的靶點與作用機制，充分將傳統中醫藥與西藥治療相結合，這將成為理論上更具有科學性、有效性、安全性的新思路[5-6]。在前期研究的探討、分析與總結基礎上，本研究主要觀察SCF、MCP-1 mRNA在顱骨骨缺損模型大鼠中的作用及通過麝香干預后對SCF、MCP-1 mRNA的表達影響，探討麝香對骨缺損修復及愈合的重要作用及作用機制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1實驗動物：300只SD大鼠，雌性150只，雄性150只，體質量(200±20)g，均由甘肅中醫藥大學SPF實驗動物中心提供，動物設施使用證明No：00000230；動物質量合格證No：62001000000201。

1.1.2藥物、試劑、設備：麝香購于甘肅蘭州安泰堂天順行藥業，由甘肅中醫藥大學中藥鑒定學教研室鑒定，為天然麝香。氯胺酮注射劑(西安力邦制藥有限公司)。SCF酶聯免疫試劑盒(Rat SCF ELISA KIT，上海酶聯生物科技有限公司，貨號：m1002853)；酶聯免疫檢測儀(型號RT-6100，深圳雷杜生命科學股份有限公司)；Trizol Reagent(invitrogen公司)；RNA的逆轉錄試劑盒(Transcriptor First Strand cDNA Synthesis Kit，promega公司)、SYBR Green Realtime PCR Master Mix(toyobo公司)；Agilent Technologies(SureCycler 8800)；PRO 200型組織勻漿器(上海季諾科貿有限公司)；顱骨鉆(南韓STRONG 90)；CT14RD臺式高速冷凍離心機(上海天美生化儀器設備有限公司)；Q5000微量紫外分析儀(美國Quawell公司)；7500型PCR熱循環儀(美國ABI公司)。

1.2方法

1.2.1顱骨骨缺損模型的建立：嚴格以氯胺酮0.1 g/kg體重腹腔注射大鼠，2～4 min后取俯臥位，利用自制固定板固定大鼠頭部及四肢，頭部術野處濕毛、剪毛、碘伏消毒，然后剪長約1～1.5 cm縱行切口，除去局部骨膜充分暴露顱骨。用直徑5 mm鉆頭的顱骨鉆在術野處造成直徑約5 mm的圓形骨缺損，以不損傷頭部毛細血管及硬腦膜為原則，用無菌生理鹽水沖洗骨缺損區域，去除殘存骨屑，然后逐層縫合，縫完皮膚層后用碘伏消毒傷口[7]。

1.2.2分組與給藥：所有模型大鼠稱重，按體重編號，采用完全隨機法分為給藥組與模型組，每組各150只，然后再將這兩組通過完全隨機法分別分為3小組，每組50只。給藥組灌服麝香，以4.2 mg/100 g為計算標準，灌胃劑量按人與大鼠體重的折算公式計算，麝香通過研缽將其充分研磨后溶于折算后蒸餾水中反復吹打，模型組灌服等體積的生理鹽水，兩組均每日灌服一次，分別持續灌服7 d、14 d、28 d。

1.2.3檢測標本制備：對所有模型大鼠持續灌胃7 d時，分別對給藥組(第1組)、模型組(第4組)大鼠進行股動脈采血及顱骨骨缺損處取材；持續灌胃14 d時，分別對給藥組(第2組)、模型組(第5組)大鼠進行股動脈采血及顱骨骨缺損處取材；持續灌胃28 d時，分別對給藥組(第3組)、模型組(第6組)大鼠進行股動脈采血及顱骨骨缺損處取材；將每次取出的血液3 000 r/min離心10～15 min，取上清，放置-20℃冰箱備用。將每次制備的顱骨骨缺損樣本標號、液氮冷凍、放入冷凍管，放置-80 ℃冰箱備用。

1.2.4SCF含量測定：參照Jian1等[8]的方法，按照SCF試劑盒檢測說明書操作，實驗結果以酶標儀讀數為準。具體步驟：稀釋標準品→加樣品及標準品→加酶→顯色液A、B→加入終止液→15 min內450 nm波長測OD值。根據OD值和標準物濃度繪制標準曲線，將OD值代入相應公式計算最終濃度。

1.2.5MCP-1 mRNA含量測定：參照 Xu等[9]的方法：①按照Trizol法提取組織總RNA說明書操作，取100 mg骨缺損組織加入1 ml Trizol，用小剪刀將其剪碎，利用勻漿器將骨組織充分勻漿，依照提取步驟提取骨缺損組織總RNA，通過微量紫外分析儀檢測總RNA濃度與純度，瓊脂糖凝膠電泳分析RNA的完整性。②各組取16 ul總RNA聯合promega RNA逆轉錄試劑盒其他試劑形成40 ul體系逆轉錄為cDNA。③以完成逆轉cDNA為模板按照SYBR Green Realtime PCR Master Mix說明書操作加入相關試劑及引物最終成20 ul體積進行PCR擴增。引物序列如表1，具體反應條件：95 ℃預變性2 min；95 ℃變性15 s，61 ℃退火30 s，95 ℃退火15 s，60 ℃退火1 min，95 ℃退火30 s，72 ℃延伸15 s，40個循環。以7500型PCR熱循環儀分析軟件，將相對定量值RQ及處理后CT值用于統計分析。

表1 引物序列Table 1 The primer sequences

圖1 肉眼觀察顱骨骨缺損模型Fig.1 Macroscopic observation of the skull bone defect model

圖2 顱骨骨缺損處取材樣本Fig.2 Sample collection from the skull bone defect

1.3 統計學處理

2 結果

2.1 造模完成后肉眼觀察大鼠顱骨有一5 mm左右的圓形骨缺損(圖1)

2.2 顱骨骨缺損取材(圖2)

2.3 麝香對兩組顱骨骨缺損模型大鼠不同時間段內血清中SCF表達的影響

結果顯示，隨著時間的延長，模型組SCF表達水平呈遞增趨勢，與模型組比較，給藥組第7天SCF含量表達最高，且兩組間差異有顯著統計學意義(P<0.01)；給藥組第14天SCF表達水平較之前降低，與模型組比較差異無統計學意義；第28天SCF表達水平又有所增高，且與模型組比較差異有統計學意義(P<0.01)。給藥組不同時間段各組內比較差異均無統計學意義。這提示在麝香的干預下，可能主要通過上調SCF表達水平來促使骨缺損區域的修復愈合，與模型組比較，第7天和第28天其表達均增高，但第7天表達更加顯著。見表2。

表2 大鼠骨缺損模型血清中SCF表達Table 2 Expression of serum SCF in rat bone defect model

注：與模型組比較，*P<0.01。

2.4 麝香對兩組顱骨骨缺損模型大鼠不同時間段內顱骨骨缺損處MCP-1 mRNA表達的影響

與模型組比較，MCP-1 mRNA在第7天表達最高，且差異有統計學意義(P=0.0046)，第7天之后持續降低，第28天接近于模型組，給藥組第14天與第28天與模型組比較差異均無統計學意義(P>0.05)，給藥組各時間段比較顯示，第7天和第28天比較差異有顯著性統計學意義(P=0.001)。說明通過對顱骨骨缺損模型大鼠不同時間段灌服麝香后，MCP-1 mRNA可能在第7天出現高表達有助于缺損區的修復，縮短愈合時間。見表3。

表3 大鼠骨缺損模型骨缺損組織中MCP-1 mRNA表達水平Table 3 Expression of mRNA MCP-1 in bone defect of rat bone defect model

注：與模型組比較，*P<0.01。

MCP-1擴增曲線前期曲線基線平整，低濃度樣本指數期明顯，各反應管的擴增效率相近，為較理想的擴增曲線，見圖3。圖4顯示其溶解曲線呈單峰，說明擴增產物較純且單一，為較理想的溶解曲線。

圖3 MCP-1擴增曲線Fig.3 MCP-1 amplification curve

圖4 MCP-1溶解曲線Fig.4 MCP-1 dissolution curve

3 討論

骨折后骨缺損疾病在臨床上越來越多見，經過長期的臨床觀察及治療效果，發現治療方式的多種多樣(自體骨、異體骨、組織工程骨、人工骨修復材料等)，其治療效果均有一定程度的局限性。為了在這方面有所突破，尋求一個快速、安全、高效、低損傷的治療方法，探索其作用途徑及效果顯得尤為重要。麝香是鹿科動物成熟雄體(馬麝、原麝等)香囊中的干燥分泌物。其味辛性溫，歸心、脾、肝經，具有開竅醒神、活血通絡、散結止痛等功效，《本草綱目》記載：它有“通諸竅，開經絡，透肌骨”等功效。其性辛香走竄，臟腑筋骨、肌膚孔竅無所不達，麝香的用途十分廣泛，主要作用于溫熱病邪陷心包痰厥、猝然倒仆、氣郁暴厥、牙關緊閉及癥瘕積聚、跌打損傷等證。目前已有大量實驗證實，在骨折修復愈合微環境過程的不同時期確實存在具有誘導成骨作用的多種生長因子與細胞因子參與、調節的。傳統接骨方藥中頻繁的使用麝香治療跌打損傷、骨折等疾病，說明麝香具有引藥物直達病所的作用，但到底是哪些存在于骨細胞中的骨生長因子，并且是通過哪種途徑在特定的微環境中進行調節，從而促進機體自我修復能力，這是本實驗研究的主要內容。研究發現[10]低濃度麝香可以促使大鼠顱骨骨缺損處基質細胞衍生因子1的表達增加，促進大鼠顱骨骨缺損處骨痂形成，縮短愈合時間。本實驗主要探索麝香促使骨缺損修復愈合的機制可能與SCF、MCP-1有關。

SCF在維持造血細胞存活，促使成體干細胞增殖與分化的過程中起重要作用，不僅促進干細胞分裂，且抑制細胞凋亡[11]。SCF生物學活性的發揮主要通過與其受體c-kit結合實現，SCF在骨缺損區或骨折區通過促進骨髓基質干細胞的大量募集是骨修復與骨愈合的細胞學基礎及微環境條件下重要的前提條件。徐麗等[12]利用SD大鼠建立下頜骨缺損，采用免疫組織化學法及免疫印跡法檢測骨缺損區不同時間點SCF含量的表達情況，結果發現兩種檢測方法在骨缺損修復過程中SCF表達比正常組織中明顯增高，且與時間均呈負相關，這說明SCF在骨缺損修復過程中與促使骨髓基質干細胞分化為成骨細胞、成纖維細胞等密切相關，是一種重要的趨化因子。而本研究結果中發現SCF第7天表達最高，隨后呈現降低趨勢，這表明骨缺損在不同時期其表達作用將有所變化，這可能與骨折愈合分期存在密切關系。MCP-1作為一種對單核細胞有趨化作用的重要調控因子，具有廣泛的生物學效應，主要通過調節單核巨噬細胞的聚集或疏散而起作用，參與炎癥反應的遷移與黏附、釋放與聚集、清除致炎物質和組織修復等。因此，MCP-1不僅對骨骼的修復與重塑有重要作用，在腎病、免疫缺陷性疾病、動脈粥樣硬化、腫瘤等疾病中也扮演著重要角色[13]。相關研究表明，阻斷MCP-1 表達可明顯減緩缺血性心肌病的發展[14]；鄭力峰等[15]通過對48例腰椎間盤突出癥患者檢測髓核組織中MCP-1 mRNA表達含量，發現由于明顯的炎性細胞浸潤及炎性反應的出現，可分泌大量的細胞因子，同時使MCP-1 mRNA表達上調，這說明MCP-1會隨患者疼痛癥狀的變化而發生異常[16]，其機理與本研究基本相符，MCP-1的主要功能是趨化和激活單核細胞至炎性反應部位，骨折前期釋放大量炎性因子發生炎性反應，灌服麝香可以使MCP-1向骨缺損區大量聚集并激活微環境中相關信號通路或調節因子而發揮促愈合作用，后期隨著其炎性反應相應減少MCP-1 mRNA表達也就降低。另外有研究報道，MCP-1在正常骨組織中不表達，但在出現骨骼相關炎癥反應過程中會出現非持續性的MCP-1上調，其炎性反應程度越重MCP-1 上調越高，例如惡性原發性骨腫瘤和轉移性骨腫瘤組織中MCP-1的表達均明顯高于良性骨腫瘤[17-18]。這可能與激活相關細胞因子并調節成骨-破骨系統之間的失衡狀態，進而促使骨骼的修復與重塑有關[19]。

本實驗研究結果表明SCF、MCP-1可能參與骨缺損修復與重建的整個過程，這對促使骨折后骨缺損愈合，縮短愈合時間等方面提供了新的思路，對探索中藥在中醫理論的指導下參與疾病的修復及治療方面有重要意義。但尚存在一些仍需要繼續研究探索的問題，例如SCF、MCP-1趨化因子是通過哪種信號轉導通路起修復作用；雖然得出促使骨缺損修復的機制可能與增加SCF、MCP-1mRNA有關，但其修復效果的最佳時間點仍需要大樣本、多層次的基礎研究；是否存在具有相同作用或更好療效的其他因子以及表達量不同的具體作用機制，這些問題的解決才能進一步為臨床治療骨缺損疾病提供有力的依據。