晚期糖基化終產物與輸卵管因素不孕癥患者卵子發育不良的關系

李雪梅，劉 紅，林碎玲，張華坤，譚斯勻，成艷君

南方醫科大學附屬深圳市婦幼保健院生殖醫學中心，廣東 深圳 518048

晚期糖基化終產物與輸卵管因素不孕癥患者卵子發育不良的關系

李雪梅，劉 紅，林碎玲，張華坤，譚斯勻，成艷君

南方醫科大學附屬深圳市婦幼保健院生殖醫學中心，廣東 深圳 518048

目的探討晚期糖基化終產物（AGEs）對卵子質量及顆粒細胞功能的影響。方法選擇2015年2～6月，因輸卵管因素行體外受精助孕的患者，年齡＜35歲，獲卵數≥8個，以長效長方案促排卵，取卵時收集所有卵泡液和顆粒細胞凍存。共有19例入選，將優質胚胎率＞35%的分為A組（n=10），優質胚胎率＜35%的分為B組（n=9）。采用酶聯免疫吸附試驗抗體夾心法檢測取卵日卵泡液AGEs和活性氧水平，采用Real-time PCR檢測顆粒細胞RAGE mRNA表達，分析兩組之間有無差異。結果兩組患者一般資料比較差異無統計學意義，兩組的平均優胚數（5.2±2.34vs1.50±1.08，P=0.001）和優胚率（60.27%±12.48%vs21.48%±14.02%，P=0.000）差異有統計學意義；兩組患者卵泡液活性氧水平（0.82±0.28 ng/mLvs1.11±0.27 ng/mL，P=0.000）差異有統計學意義，卵泡液AGEs水平（0.33±0.13 μg/mLvs0.35±0.13 μg/mL,P=0.462）差異無統計學意義，顆粒細胞RAGE水平（1.55±0.62 pg/mLvs3.75±1.75 pg/mL，P=0.005）差異有統計學意義。結論氧化應激狀態可能是輸卵管因素的年輕不孕癥患者卵子質量低下的原因，但AGES-RAGE可能并不是其作用途徑。

晚期糖基化終產物；顆粒細胞；卵泡液；氧化應激

體外受精-胚胎移植（IVF-ET）技術自1978年應用于臨床以來，隨著臨床和實驗室培養技術逐步提高，臨床妊娠率由最初的5%左右提高到現在的50%以上。一般認為，年齡是影響卵子質量及妊娠率的重要因素[1]，但是對于年輕（＜35歲）、卵巢功能正常的患者，在合適的促排卵方案和穩定的實驗室條件下，不同的患者卵子質量不同，胚胎質量差別甚大，年輕的患者甚至出現無可用胚胎而取消胚胎移植的情況，即使移植也妊娠率甚低。

氧化應激是引起卵子及后續胚胎發育不良的重要原因[2]，晚期糖基化終產物（AGEs）通過其受體（RAGE）誘導細胞內活性氧（ROS）產生，可能參與卵子發育不良的形成。對于AGEs與卵子質量的關系的研究，以往大多集中于分析高齡婦女、多囊卵巢綜合征（PCOS）患者及糖尿病患者等[3-7]，鮮見探討AGEs對年輕的輸卵管因素不孕癥患者卵子質量的影響。本課題通過檢測此研究組IVF患者卵泡液及顆粒細胞的AGEs、RAGE和ROS水平，分析其與卵子質量、后續胚胎發育之間的關系，探討AGEs與不明原因卵子發育不良的關系，擬尋找這些患者卵子質量低下的原因，為下一步改善其妊娠結局提供新的治療思路。本研究經本院醫學倫理委員會及深圳市衛生和計劃生育委員會審查批準，所有患者術前均簽署知情同意書。

1 資料與方法

1.1 病例資料

研究選擇2015年2～6月，在我院生殖醫學中心行IVF助孕的患者。納入標準：輸卵管因素的不孕癥患者，女方年齡＜35歲，獲卵數≥8個，所有患者以長效長方案促排卵，取卵時收集所有卵泡液和顆粒細胞凍存。排除標準：子宮內膜異位癥、子宮內膜息肉或宮腔粘連、子宮畸形、子宮肌瘤、卵巢功能下降、夫婦任何一方染色體異常或有全身系統性疾病、既往有不良孕產史、男性因素不孕。分組：根據胚胎培養結果，共有19例患者入選，將優質胚胎率＞35%的分為A組（n=10），優質胚胎率＜35%的分為B組（n=9）。

1.2 實驗方法

1.2.1 卵泡液和顆粒細胞的收集 將收集的所有卵泡液置45%的Percoll上離心，1500 r/min，15 min；將上層的卵泡液分裝于EP管，標記后直接凍存-70 ℃待檢；顆粒細胞位于Percoll液面上呈一層白膜，吸取顆粒細胞，分裝于EP管，標記后直接凍存-80 ℃待檢。

1.2.2 檢測方法 采用酶聯免疫吸附試驗（ELISA）抗體夾心法檢測取卵日卵泡液AGEs和ROS水平。用Percoll分離法收集顆粒細胞。Trizol法提取總RNA并逆轉錄為cDNA，接著進行RAGE基因實時熒光定量PCR（Realtime-PCR），采用AACt法計算RAGEmRNA的相對表達量。

1.3 統計學方法

采用SPSS19.0統計軟件進行數據的統計分析，率的比較采用χ2檢驗。對計量資料進行正態性檢驗，服從正態分布者組間比較采用t檢驗。結果用均數±標準差表示。設置雙側檢驗，P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 一般資料比較

A、B兩組患者的基本資料統計結果（表1），在年齡、不孕年限、啟動日性激素水平、HCG日性激素水平、獲卵數、2PN數等方面比較均差異無統計學意義；兩組平均優胚數（5.2±2.34vs1.50±1.08，P=0.001）和平均優胚率[（60.27±12.48）%vs（21.48±14.02）%，P=0.000]差異有統計學意義。

2.2 兩組卵泡液ROS、AGES和顆粒細胞RAGE比較

A組卵泡液ROS水平和RAGE水平均低于B組（P＜0.05），AGES差異無統計學意義（P＞0.05，表2）。

表1 兩組患者的基本資料比較（）

表1 兩組患者的基本資料比較（）

*P＜0.05.

項目 A組（n=10） B組（n=9）P女方年齡（歲）31.3±3.3729.4±2.550.172不孕年限（年）4.6±3.133.2±2.440.28 Gn天數（d）11±2.3610.7±1.640.745 Gn總量（U）2047.5±602.131691.25±635.770.215啟動日FSH（mU/mL）2.67±0.972.86±1.550.749 LH（mU/mL）1.26±0.941.52±1.00.551 E2（pg/mL）17.2±11.9317.8±9.440.902P（pmol/mL）0.38±0.210.56±0.320.166 HCG日LH（mU/mL）1.74±1.301.72±0.980.957 E2（pg/mL）3272.9±983.063468.6±1029.480.669P（pmol/mL）1.04±0.241.11±0.460.702獲卵數13.3±2.4514.5±4.740.486平均E2值/卵（pg/mL）245.40±54.96252.68±94.850.836 MII卵率（%）82.67±16.9184.0±12.720.810 2PN率（%）64.7±22.9072.65±13.190.356平均優胚數5.2±2.341.50±1.080.001*優胚率（%）60.27±12.4821.48±14.020.000*

表2 兩組ROS、AGES和RAGE水平比較

3 討論

AGEs是人體衰老的生物學指標之一，存在于正常人體許多組織和細胞，通過直接或與受體RAGE結合，誘導多種組織氧化應激及炎癥反應，通過間接途徑損傷機體。研究[3-9]發現整體及卵巢局部中高水平AGEs、RAGE高表達與女性不孕及不良妊娠結局密切相關，并且卵泡液AGEs濃度與IVF周期卵巢反應和卵子質量相關。推測AGEs可能通過參與卵泡內氧化應激，造成卵子質量低下。

AGEs通過結合其受體RAGE誘導氧化應激及炎癥反應，與細胞凋亡及組織損害有關[5]。而AGERAGE相互作用參與機體多器官多系統疾病發病，如神經系統、心血管系統、免疫系統及運動系統相關疾病[10]。長時間暴露于AGEs可能引起原始卵泡和卵巢間質血管氧化損傷，促進卵泡生成過程中卵巢微環境中ROS升高。進而會危害顆粒細胞代謝、抗氧化防御體系和卵泡周圍血管化的形成，危及卵子成熟、染色體組成和卵母細胞發育能力。伴隨線粒體功能障礙的抗氧化及抗糖基化防御體系下降可能是一個正反饋環的驅動力量，該正反饋環包含氧化應激、羥基應激和逐漸積聚的AGEs。

卵母細胞胞漿成熟和減數分裂能力的恢復和完成是在卵泡發育過程中獲得的，卵泡環境決定卵子發育潛能，不適宜的卵泡生長微環境是卵母細胞質量改變的重要影響因素。有研究顯示[11-12]，卵泡液ROS水平過高，可能導致卵母細胞氧化應激，對卵母細胞成熟和后續胚胎發育造成不良影響，并可能是年齡相關的卵母細胞改變的原因之一。生殖細胞富含不飽和脂肪酸，特別容易受到氧化應激損傷。ROS可通過直接影響細胞內鈣離子儲存結構，干擾鈣離子動態平衡，引起卵母細胞減數分裂停滯和降解，繼而發生調亡。

Jinno等[13]研究發現AGEs濃度與取卵日雌激素水平、優勢卵泡數、獲卵數、雙原核（2PN）受精數、可利用胚胎數呈負相關，AGE濃度大于7.24 U/mL提示低獲卵數及不好的妊娠結局，是年齡及卵巢儲備預測ART的結局。本研究結果發現：PCOS患者卵泡液內sRAGE、VEGF與卵巢儲備能力相關，兩者相互作用會影響卵子質量；而PCOS患者顆粒細胞的RAGE mRNA表達量顯著高于同年齡段的非PCOS患者，且其卵泡液AGEs水平亦有升高趨勢[14-15]。提示PCOS患者卵巢局部氧化應激增加。潘曉琴[16]的研究表明：卵泡液AGEs水平升高可能是卵巢低反應發生的原因之一；卵泡液AGEs水平升高上調顆粒細胞RAGE mRNA表達，推測AGEs與受體RAGE結合途徑可能是AGEs對卵巢功能產生影響的主要途徑。

本研究結果顯示，優胚率較低患者的卵泡液ROS水平較優胚率高的患者高，有統計學意義；提示卵泡液ROS水平過高，誘發卵母細胞氧化應激，可能是卵子質量低下及后續胚胎發育不良的原因；然而，兩組卵泡液AGEs水平并無統計學差異，而優胚率較低的患者，其顆粒細胞RAGE mRNA水平更高，似乎ROS水平升高并不是AGEs-RAGE結合途徑造成的，其原因尚不清楚。本研究結果與文獻[14-15]的不同，可能與研究人群不同有關，對于PCOS尤其是伴有胰島素抵抗的患者，存在C反應蛋白、sRAGE和血管內皮生長因子的代謝異常，提示PCOS患者不僅僅存在內分泌代謝異常，而且還存在慢性炎癥狀態，胰島素抵抗可能是導致慢性炎癥的重要機制，兩者之間互相促進發展形成惡性循環；而本研究的人群是輸卵管因素的年輕不孕癥患者，盆腔炎癥狀態可能是引起氧化應激的原因，但其作用途徑并不是經過AGEs-RAGE，尚待進一步研究證實。

總之，氧化應激狀態可能是輸卵管因素的年輕不孕癥患者卵子質量低下的原因，但AGES-RAGE可能并不是其作用途徑，改善其氧化應激狀態可能有助于提高卵子質量，獲得更好的妊娠結局。

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Relationship between AGEs and oocytes dysplasia of patients with tubal factor infertility

LI Xuemei, LIU Hong, LIN Suiling, ZHANG Huakun, TAN Siyun, CHENG Yanjun
Reproductive Medicine Center, Maternity and Child Healthcare Hospital of Shenzhen Affiliated to Southern Medical University, Shenzhen 518048, China

ObjectiveTo access the effect of advanced glycation end products（AGEs） on oocyte quality and granulosa cell function for patients with tubal factor infertility.MethodsFrom February 2015 to June 2015, 19 IVF patients with tubal factor were enrolled. All patients were ＜35 years old.They were controlled ovarian hyperstimulation (COH) with long-acting long protocol and retrieved ≥8 oocytes. Their follicular fluid and granulosa cells were collected during ovum pick-up (OPU) and cryopreserved at -80 ℃. The patients were devided into 2 groups: Group A of 10 patients with high quality embryo rate ＞35%and group B of 9 patients with high quality embryo rate ＜35%. Follicular fluid AGEs and ROS levels on OPU day were detected by sandwiched ELISA, and the RAGE mRNA expression of granulosa cells were detected by Real-time PCR.ResultsThere were no significant differences of general informations between two groups (P＞0.05). There were significant differences in average numbers of high quality embryos (5.2±2.34vs1.50±1.08,P=0.001) and the high quality embryo rate (60.27±12.48vs21.48±14.02,P=0.000). Follicular fluid ROS levels in 2 groups were significantly different (0.82±0.28vs1.11±0.27 ng/mL,P=0.000). The follicular fluid AGES level in 2 groups were not significantly different (0.33±0.13vs0.35±0.13 μg/mL,P=0.462).ConclusionThe oxidative status may be the reason of oocytes dysplasia in the young patients with tubal factor infertility. But AGES-RAGE probably was not the mechanism.

advanced glycation end products; granulosa cells; follicular fluid; embryo quality

2017-04-02

深圳市醫療衛生類科研項目（201302114）

李雪梅，主任醫師，E-mail: 842326015@qq.com