脂多糖在創傷性顱腦損傷炎癥反應中的應用

樊友道，尹海斌，張旺明，黃 鳴，周金菊佛山市南海區第三人民醫院腦科，廣東 佛山 5844；南方醫科大學珠江醫院神經外科，廣東 廣州 5080

脂多糖在創傷性顱腦損傷炎癥反應中的應用

樊友道1，尹海斌1，張旺明2，黃 鳴1，周金菊1
1佛山市南海區第三人民醫院腦科，廣東 佛山 528244；2南方醫科大學珠江醫院神經外科，廣東 廣州 510280

目的評價分析脂多糖在創傷性顱腦損傷（TBI）炎癥反應中的應用價值。方法選擇2014年6月～2016年12月期間佛山市南海區第三人民醫院腦科和南方醫科大學珠江醫院神經外科收治的TBI患者86例，并按照格拉斯哥昏迷評分分為3組：輕度組33例、中度組24例、重度組29例；并且選取同期來本院進行體檢的健康者28例作為對照組。通過ELISA方法檢測研究對象血清中TNF-α、IL-6、IL-1β，GREISS法檢測一氧化氮含量。結果輕度組、中度組及重度組患者入院時的血清TNF-α濃度均有升高，其中第3天為最高，第5、7天已逐漸降低，但仍高于對照組。輕度組、中度組及重度組患者入院時的血清IL-6濃度均升高，其中第5天為最高，第7天已開始降低，仍高于對照組；TBI嚴重分級與血清IL-6濃度（r=0.925，P＜0.05）。輕度組、中度組及重度組患者入院時的血清IL-1β濃度均升高，第1、3、5天緩慢增加，第7天增加更加顯著，重度組升高幅度明顯高于對照組、輕度組和中度組（P＜0.05）。TBI嚴重分級與血清IL-1β濃度（r=1.267，P＜0.05）。輕度組、中度組及重度組患者入院時的血清一氧化氮濃度有升高，其中第3天為升高較明顯，第5、7天已逐漸降低，仍高于對照組；TBI嚴重分級與血清一氧化氮濃度（r=0.847，P＜0.05）。結論脂多糖在TBI患者體內存在不同程度的炎癥反應；血清中TNF-α、IL-6、IL-1β、一氧化氮濃度變化與TBI程度密切相關；如果濃度持續保持較高水平，這就說明腦組織損傷嚴重，預后效果不佳。

創傷性顱腦損傷；脂多糖；血清TNF-α: IL-6；IL-1β；一氧化氮

創傷性顱腦損傷（TBI）嚴重影響人類的生活質量和壽命，其發病率、致殘率和死亡率顯著增高，給家庭生活帶來極大的影響[1-3]。選用何種方法早期保護顱腦損傷患者的繼發性腦損傷，促進腦功能盡早恢復十分重要。炎癥細胞因子是TBI病理生理過程中的一個重要組成環節，雖可增強機體的抵抗力，有效促進組織修復，但會因過度激活所導致的強烈全身性炎癥反應，反而加重繼發性腦損傷[4]。楊璽等[5]研究結果顯示，運用星狀神經節阻滯可以減輕TBI患者的炎癥反應，抑制淋巴細胞NF-κB和AP-1的激活。運用糖皮質激素、內毒素抗體、TNF抗體、IL-1受體拮抗劑、IL-6受體拮抗劑、緩激肽拮抗劑、七葉皂苷、褪黑素、血液透析等抑制或清除炎癥介質[6-7]，取得了一定療效，但尚未達到滿意的效果。脂多糖（LPS）是由核心多糖、O抗原鏈和類脂A 3部分構成，也被稱為內毒素，是革蘭氏陰性菌外膜的主要組成成分，細胞內ROS水平少量升高，都可刺激FOXOs轉錄因子蛋白家族，使其轉錄活性增加，因此，LPS也是導致炎癥和人體天然免疫反應的主要誘因[8-10]。是否可以通過阻斷LPS對小膠質細胞的激活過程，從而抑制炎性細胞因子的分泌，減少炎癥反應對腦組織的損傷需進一步研究，同時LPS也許可以成為預測TBI預后的一個新指標。綜合國內相關文獻并與查新對比分析，國內較多報道TBI后TNF-α、IL-6、IL-1β等的變化及臨床意義，但未見涉及一氧化氮（NO）在不同程度TBI中的變化規律及與預后相關研究和探討。本研究通過評價分析LPS在TBI炎癥反應血清中TNF-α、IL-6、IL-1β、NO水平中的應用價值，為提高TBI臨床治療，改善患者預后提供客觀科學合理的指導。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選擇2014年6月～2016年12月期間佛山市南海區第三人民醫院腦科和南方醫科大學珠江醫院神經外科收治的TBI患者86例，患者均經頭顱CT或MRI掃描確診。其中男性66例，女性20例，年齡18～78歲，平均45.79±12.83歲；并按照格拉斯哥昏迷（GCS）評分分為3組：輕度組33例（GCS評分13～15分），占38.37%（33/86），男26例，女7例，年齡18～62歲，平均43.54±10.27歲；中度組24例（GCS評分9～12分），占27.91%（24/86），男19例，女5例，年齡20～71歲，平均年齡45.81±11.45歲；重度組29例（GCS評分3～8分），占27.91%（24/86），男性21例，女性8例，年齡23～78歲，平均46.78±13.09歲。均為傷后24 h內入院。

排除標準：（1）嚴重的心、腦血管等器質性病變或肝腎功能不全等慢性病史；（2）失血性休克；（3）妊娠期及哺乳期婦女；（4）傷前血液病、感染等疾??；（5）精神病患者。本組TBI患者86例中，腦挫裂傷51例（59.30%），外傷性蛛網膜下腔出血15例（17.44%），硬膜下血腫10例（11.63%），腦挫裂傷合并硬膜外血腫6例（6.98%），腦內血腫4例（4.65%）。重度組29例入院后接受了開顱血腫清除術或去骨瓣減壓術。

選取2014年6月～2016年12月期間到醫院進行體檢的健康者28例作為對照組。遵循赫爾辛基宣言和中國臨床試驗的相關法規，經本院倫理委員會研究決定，所有參加本實驗研究的患者或家屬均全部自愿簽署知情同意書。4組患者的年齡、性別構成比等基線資料均無統計學差異（P＞0.05），具有可比性。

1.2 方法

所有病例均在入院第1、3、5、7天晨起分別采空腹肘部靜脈血5 mL，對照組體檢的健康者只采空腹肘部靜脈血5 mL血1次，置于干燥管中，37 ℃恒溫培養箱（蘇州江東精密儀器）保存待測。室溫下3000 r/min臺式離心機（德國Thermo）離心15 min去上清液，將血清置于低溫-20 ℃冰箱（海爾）中待測。LPS（Escherchia coli，serotype 026：B6，Sigma），用無菌的0.9%氯化鈉稀釋為1 mg/mL，儲存于冰箱備用。采用雙抗體夾心酶聯免疫吸附法炎癥相關指標測定血清腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、白細胞介素-6（IL-6）、白細胞介素-1β（IL-1β）含量的變化。GREISS法檢測NO含量，試劑盒購買自美國Raybiotech，其余試劑均為分析純。

1.3 統計學分析

采用社會科學統計軟件包SPSS18.0計算分析，計量資料以均數±標準差表示，兩組比較采用t檢驗，各數據之間相關性采用Pearson相關、多元逐步回歸法分析，以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 LPS在TBI患者血清中TNF-α濃度變化的比較

輕度組、中度組及重度組患者入院時的血清TNF-α濃度均有升高，其中第3天最高，第5、7天逐漸降低，但仍高于對照組（表1）；相關性分析顯示，TBI嚴重分級與血清TNF-α濃度相關（r=1.873，P＜0.05）。

表1 LPS在TBI患者血清中TNF-α濃度變化的比較（，pg/mL）

表1 LPS在TBI患者血清中TNF-α濃度變化的比較（，pg/mL）

#P＜0.05vs其它3組.

組別n第1天第3天第5天第7天對照組28137.95±9.36137.95±9.36137.95±9.36137.95±9.36輕度組29210.85±7.23191.68±7.64176.88±9.21158.19±8.05中度組24225.67±6.49233.89±7.52222.92±8.63193.86±8.55重度組33247.98±7.72#268.37±9.76#244.75±8.41#218.35±9.32#

2.2 LPS在TBI患者血清中IL-6濃度變化的比較

輕度組、中度組及重度組患者入院時的血清IL-6濃度均升高，其中第5天為最高，第7天已開始降低，但仍高于對照組（表2）；相關性分析表明，TBI嚴重分級與血清IL-6濃度相關（r=0.925，P＜0.05）。

2.3 LPS在TBI患者血清中IL-1β濃度變化的比較

輕度組、中度組及重度組患者入院時的血清IL-1β濃度均升高，第1、3、5天緩慢增加，第7天增加更加顯著，重度組升高幅度明顯高于對照組、輕度組和中度組（P＜0.05，表3）。相關性分析表明，TBI嚴重分級與血清IL-1β濃度（r=1.267，P＜0.05）。

2.4 LPS在TBI患者血清中NO濃度變化的比較

輕度組、中度組及重度組患者入院時的血清血清NO濃度有升高，其中第3天為升高較明顯，第5、7天已逐漸降低，并且仍高于對照組（表4）；相關性分析表明，TBI嚴重分級與血清NO濃度相關（r=0.847，P＜0.05）。

表2 LPS在TBI患者血清中IL-6濃度變化的比較（，pg/mL）

表2 LPS在TBI患者血清中IL-6濃度變化的比較（，pg/mL）

#P＜0.05vs其它3組.

組別n第1天第3天第5天第7天對照組28 6.98±0.71 6.98±0.71 6.98±0.71 6.98±0.71輕度組2912.17±1.7519.05±3.0236.10±2.8729.13±2.82中度組2444.39±2.2253.57±4.8978.19±6.0768.15±6.39重度組33 103.15±12.06#143.41±20.04#233.15±11.16#168.41±33.01#

表3 LPS在TBI患者血清中IL-1β濃度變化的比較（，pg/mL）

表3 LPS在TBI患者血清中IL-1β濃度變化的比較（，pg/mL）

#P＜0.05vs其它3組.

組別n第1天第3天第5天第7天對照組2861.56±11.4961.56±11.4961.56±11.4961.56±11.49輕度組2995.92±10.16122.49±4.92136.42±2.96171.23±3.87中度組24148.61±6.25183.88±5.12199.79±4.02377.52±49.49重度組33214.23±6.27#233.61±8.29#272.91±18.32#472.73±13.17#

表4 LPS在TBI患者血清中NO濃度變化的比較（，pg/mL）

表4 LPS在TBI患者血清中NO濃度變化的比較（，pg/mL）

#P＜0.05vs其它3組.

組別n第1天第3天第5天第7天對照組2829.38±5.5729.38±5.5729.38±5.5729.38±5.57輕度組2938.59±5.7739.98±7.3134.65±6.5131.66±5.71中度組2444.68±6.4946.19±8.3842.98±8.3338.78±6.76重度組3348.87±6.65#51.28±8.87#46.47±7.29#41.26±6.98#

3 討論

TBI后的繼發性腦損害是導致腦損傷高病死率、高致殘率的重要原因，TBI能夠導致機體釋放大量的炎性細胞因子，目前認為炎癥細胞因子是合并腦水腫、腦缺血、顱內壓增高等病理生理過程中的一個重要組成環節[11-12]。LPS是內毒素的主要成份，能引起廣泛的炎癥反應[13]。IL-1β和TNF-α的短暫上調，表明急性炎癥反應時，細胞因子的產生受到嚴格控制，進而引發營養因子的產生，有利于損傷神經元的恢復[14]。細胞因子的表達變化，由初始的神經保護作用轉變為加重神經元的損傷，體現出持續激活小膠質細胞的不利方面[15-16]。TBI造成的局部組織損傷引起的炎癥反應對于損傷細胞碎片的清除是必不可少的。TNF-a對人皮層神經元和類神經元具有毒性作用，小膠質細胞在LPS的作用下可以被激活而釋放TNF-α，TNF-a的表達能夠容易轉基因小鼠腦病及神經退行性病理改變[17]。本研究結果表明，輕度組、中度組及重度組患者入院時的血清TNF-α濃度均降低，TBI嚴重分級與血清TNF-α濃度相關。

尤其是在TBI早期，神經細胞和局部血管等組織遭到嚴重的破壞，誘發各種炎癥反應，白介素是由白細胞分泌的一類調節細胞生長與分化的細胞因子，血中則就會產生大量的促炎因子（IL-6、IL-1β和TNF-α），通過這些介質幾乎影響所有的免疫細胞、內皮細胞參與炎癥反應和組織損傷。小膠質細胞在多種神經系統疾病中發揮重要作用，它還參與大腦的損傷和修復過程，可以起到神經保護作用，能夠進行迅速響應大腦中的病理刺激，并參與一系列免疫反應，其相關研究越來越多。星形膠質細胞通過基因表達、形態發生和細胞增殖等改變對不同形式的TBI做出反應[18-19]。

LPS是一種強力炎性反應誘導劑，能夠迅速地激活小膠質細胞，釋放許多致炎性細胞因子和一系列活性產物，對神經元細胞產生毒性作用，是導致炎癥和人體天然免疫反應的主要誘因[20]。LPS能夠顯著升高BV-2細胞中TNF-α的表達及其上清液中TNF-α的濃度，同時還有效的改變BV-2細胞的形態，使其胞體變大、突起變短[21-22]。IL-6除能夠破壞微循環，損傷神經細胞，加重腦水腫，并且能夠通過活化血小板和粒細胞加重腦組織損害。本研究結果表明，輕度組、中度組及重度組患者入院時的血清IL-6濃度均升高，TBI嚴重分級與血清IL-6濃度相關。IL-1β主要在吞噬性的小膠質細胞和巨噬細胞上表達，對腦缺血晚期炎性反應有一定的調節作用。本研究結果表明，輕度組、中度組及重度組患者入院時的血清IL-1β濃度均升高，重度組升高幅度明顯高于對照組、輕度組和中度組，TBI嚴重分級與血清IL-1β濃度相關。NO的化學性質非常活潑，能夠徹底的改變細胞的脂多糖和蛋白結構，導致信號轉導機制的失衡并引起細胞毒性。本研究結果顯示輕度組、中度組及重度組患者入院時的血清NO濃度有升高，TBI嚴重分級與血清NO濃度相關。

綜上所述，LPS在TBI患者體內存在不同程度的炎癥反應，不同程度TBI及TBI不同時間點，血清中TNF-α、IL-6、IL-1β、NO水平變化及規律提示LPS參與了TBI的病理生理過程，并表現出與TBI程度呈正相關。本文采用動態檢測血清中TNF-α、IL-6、IL-1β、NO濃度；與單項檢測相比反應顱腦損傷更全面；由此通過檢測血清中TNF-α、IL-6、IL-1β、NO濃度的變化，能夠有效的為臨床提供腦組織損傷嚴重程度的客觀依據，盡早評估患者預后，對臨床病情的判斷、治療顯得尤為重要。但LPS在TBI體內不同程度的炎癥反應之間的機制是什么，血清中TNF-α、IL-6、IL-1β、NO是否充分代表、反映腦損傷本質，能否通過藥物或方法降低、甚至阻斷LPS對炎癥細胞的激活過程，減少炎癥反應對腦組織的繼發損傷，仍需要進一步探討和研究。

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Application of lipopolysaccharide on inflammatory reaction of traumatic brain injury

FAN Youdao1, YIN Haibin1, ZHANG Wangming2, HUANG Ming1, ZHOU Jinju11Department of Brain, Third People's Hospital of Nanhai Foshan, Foshan 528244, China;2Department of Neurosurgery, Zhujiang Hospital Affiliated to Southern Medical University, Guangzhou 510280, China

ObjectiveTo evaluate the value of lipopolysaccharide (LPS) in invasive brain injury (TBI) inflammatory response(Inflammation).MethodsEighty-six patients with TBI in Third People's Hospital of Nanhai Foshan were enrolled.They were divided into 3 groups according to the Glasgow coma scale (GCS) score, with mild group of 33 cases, moderate group of 24 cases and severe group of 29 cases. Twenty-eight cases with health examination in the same period were selected as a control group.The levels of nitric oxide (NO) in serum were detected by GREISS. The levels of TNF-α, IL-6, IL-1β and were measured by ELISA.ResultsThe levels of serum TNF-α were increased in the mild, moderate and severe groups, and the third day was the highest. The levels of serum TNF-α on the 5th and 7th day were gradually decreased and still higher than the control group. The levels of serum IL-6 in the mild, moderate and severe groups were higher than those in the control group (P＜0.05).The level of IL-6 in the mild and moderate group was significantly higher than that in the control group (r=0.925,P＜0.05). The levels of serum IL-1β in the mild group, moderate group and severe group were higher than those in the control group, and the increasement was significant on the third , fifth day (P＜0.05). The severity of TBI was correlated with serum IL-1β concentration (r=1.267,P＜0.05). The levels of serum NO in the mild, moderate and severe groups were significantly higher than those in the control group (P＜0.05), and serum NO levels on the third day was higher than that in the control group. NO concentration was correlated with the severity of TBI (r=0.847,P＜0.05).ConclusionThe changes of TNF-α, IL-6, IL-1β and NO in serum are closely related to the degree of TBI. High NO concentration means a serious brain tissue injury and poor prognosis.

traumatic brain injury; lipopolysaccharide; serum TNF-α: IL-6; IL-1β; nitric oxide

2017-05-03

廣東省佛山市醫學類科技攻關項目（2015AB000352）

樊友道，E-mail: 1651807280@qq.com