液基薄層細(xì)胞涂片在胸腹水診斷中的應(yīng)用價值

禹 樂， 孟加榕， 朱啟淦， 楊立民， 溫路生， 魁國菊， 潘羨心

(解放軍第175醫(yī)院，廈門大學(xué)附屬東南醫(yī)院病理科，漳州 363000； *通訊作者，E-mail：mengjiarong@sina.com)

液基薄層細(xì)胞涂片在胸腹水診斷中的應(yīng)用價值

禹 樂， 孟加榕*， 朱啟淦， 楊立民， 溫路生， 魁國菊， 潘羨心

(解放軍第175醫(yī)院，廈門大學(xué)附屬東南醫(yī)院病理科，漳州 363000；*通訊作者，E-mail：mengjiarong@sina.com)

目的 探討液基薄層細(xì)胞涂片法在胸腹水診斷中的應(yīng)用價值。 方法 選取臨床科室送檢的可疑陽性胸腹水107例，分別采用液基薄層細(xì)胞涂片法和傳統(tǒng)細(xì)胞涂片法制片，必要時分別行免疫細(xì)胞化學(xué)染色，比較兩種方法的涂片質(zhì)量及惡性腫瘤的確診率。 結(jié)果 應(yīng)用液基薄層細(xì)胞涂片技術(shù)獲得的細(xì)胞涂片及免疫細(xì)胞化學(xué)染色效果均優(yōu)于傳統(tǒng)涂片法，統(tǒng)計結(jié)果顯示液基薄層細(xì)胞涂片法的惡性腫瘤確診率為30.8%，高于傳統(tǒng)細(xì)胞涂片法的11.2%，兩組確診率差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。 結(jié)論 液基薄層細(xì)胞涂片法在胸腹水診斷中可以提高惡性腫瘤確診率，且涂片質(zhì)量、染色效果均優(yōu)于常規(guī)涂片法。

胸水； 腹水； 細(xì)胞學(xué)； 免疫細(xì)胞化學(xué)染色

胸腹水是常見的臨床體征，病因非常復(fù)雜，其良惡性的鑒別也是臨床上的難點，惡性胸腹水常見于原發(fā)性或轉(zhuǎn)移性腫瘤，胸腹水的良惡性鑒別診斷對臨床醫(yī)生在治療上有重要的指導(dǎo)意義[1]。由于傳統(tǒng)的胸腹水制片方法易受到胸腹水的新鮮程度、細(xì)胞數(shù)量、退變程度、血細(xì)胞含量多少、固定狀態(tài)以及染色情況等因素的影響，給病理診斷帶來較大的困擾，特別是對于高度增生的間皮細(xì)胞、良惡性間皮瘤細(xì)胞以及轉(zhuǎn)移性腺癌細(xì)胞的鑒別診斷更為困難[2]，因此經(jīng)常需要借助免疫細(xì)胞化學(xué)染色加以輔助鑒別診斷，現(xiàn)行基于傳統(tǒng)細(xì)胞涂片上的免疫細(xì)胞化學(xué)染色效果總是不能令人滿意。為了提高胸腹水脫落細(xì)胞學(xué)檢測惡性腫瘤的確診率并改善脫落細(xì)胞學(xué)涂片及免疫細(xì)胞化學(xué)染色的質(zhì)量，筆者對胸腹水細(xì)胞涂片的方法和免疫細(xì)胞化學(xué)染色實驗條件進(jìn)行研究，經(jīng)過長期實驗摸索出一種簡便、可靠的方法，現(xiàn)介紹如下。

1 材料和方法

1.1 材料

收集2015-01～2016-05中國人民解放軍第175醫(yī)院臨床科室送檢的可疑陽性胸腹水標(biāo)本107例，男65例，女42例。

1.2 試劑

液基細(xì)胞涂片試劑盒來自孝感泰康達(dá)醫(yī)療設(shè)備有限公司，用于免疫組織化學(xué)染色試劑均來自福州邁新公司，酸性亞硫酸鈉、蛋白酶K濃縮劑來自廈門艾德生物醫(yī)藥科技股份有限公司。

1.3 液基薄層細(xì)胞涂法

取新鮮胸腹水10 ml于試管中，2 000 r/min離心4 min，去上清液。加入液基細(xì)胞保存液5 ml于試管中，震蕩均勻后放置10 min，2 000 r/min離心4 min，去上清液，按沉淀體積約50倍的比例加入液基細(xì)胞固定液，震蕩均勻后，取1 ml細(xì)胞懸濁液加入制片模具中，1 400 r/min離心4 min，取出涂片，待晾干后HE染色。

1.4 傳統(tǒng)細(xì)胞學(xué)涂片法

胸腹水充分震蕩后，取10 ml于試管中以2 000 r/min離心4 min，將沉淀物直接涂片，95%乙醇固定后HE染色。

1.5 免疫細(xì)胞化學(xué)染色

兩種細(xì)胞涂片分別置于pH為6.0的檸檬酸溶液中高壓熱修復(fù)5 min，自然冷卻后置于3%H2O2中10 min，PBS洗滌3次，每次間隔3 min；10%的酸性亞硫酸鈉處理15 min，PBS洗滌3次，每次間隔3 min；涂片置于1%的蛋白酶K溶液中，37 ℃孵育9 min，PBS洗滌3次，每次間隔3 min。依據(jù)需要診斷需要選擇標(biāo)記抗體，滴加后37 ℃孵育1 h，PBS洗滌3次，每次間隔3 min。滴加酶標(biāo)二抗，室溫放置15 min，PBS洗滌3次，每次間隔3 min，DAB顯色液，蘇木素復(fù)染，中性樹膠封固。

1.6 診斷標(biāo)準(zhǔn)

由兩位經(jīng)驗豐富的細(xì)胞病理學(xué)診斷醫(yī)生同時閱片，診斷采用三種分類方法，分別為陰性、可疑腫瘤細(xì)胞和確診惡性腫瘤細(xì)胞，其中惡性腫瘤細(xì)胞的確診需免疫細(xì)胞化學(xué)染色進(jìn)一步確認(rèn)。

1.7 統(tǒng)計學(xué)方法

應(yīng)用SPSS 13.0統(tǒng)計分析軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，兩個率的比較選擇χ2檢驗，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 HE染色結(jié)果

傳統(tǒng)細(xì)胞涂片：胸腹水細(xì)胞涂片中的細(xì)胞薄厚不均勻、細(xì)胞成堆分布重疊較為嚴(yán)重，細(xì)胞收縮變性較為常見，結(jié)構(gòu)不清，染色晦暗，核漿對比不清晰，有大量紅細(xì)胞、炎性滲出物及黏液混雜在一起，造成背景不清晰(見圖1)。

液基薄層細(xì)胞涂片：胸腹水細(xì)胞涂片中的細(xì)胞結(jié)構(gòu)完整，分布均勻，細(xì)胞無收縮，染色鮮艷，核漿對比清晰，很少有紅細(xì)胞干擾，背景清晰(見圖2)。

圖1 胸腹水的傳統(tǒng)細(xì)胞涂片 (HE染色)Figure 1 Traditional cytology of pleural and ascitic fluid by HE

圖2 胸腹水的液基薄層細(xì)胞涂片 (HE染色)Figure 2 Thinprep cytologic smear of pleural and ascitic fluid by HE

2.2 免疫細(xì)胞化學(xué)染色結(jié)果

基于傳統(tǒng)細(xì)胞涂片的免疫細(xì)胞化學(xué)染色:涂片的細(xì)胞成堆分布重疊較為嚴(yán)重，染色效果深淺不一，背景不夠清晰，常常因大量的紅細(xì)胞、炎性滲出物及黏液作用而呈現(xiàn)出淡褐色，嚴(yán)重影響陽性結(jié)果的判讀。陽性信號定位不準(zhǔn)確，細(xì)胞膜、細(xì)胞漿、細(xì)胞核表達(dá)的抗體，均有定位于細(xì)胞漿中的錯覺，無法進(jìn)行準(zhǔn)確判別(見圖3)。

基于液基薄層細(xì)胞涂片的免疫細(xì)胞化學(xué)染色:涂片中的細(xì)胞分布均勻，密度高，紅細(xì)胞帶來的非特異性著色較少，背景清晰，染色定位準(zhǔn)確。CK7抗體較準(zhǔn)確地定位于細(xì)胞質(zhì)(見圖4A)；Ki-67抗體較準(zhǔn)確地定位于細(xì)胞核(見圖4B)；CD79a抗體比較準(zhǔn)確地定位于細(xì)胞膜(見圖4C)。

圖3 基于傳統(tǒng)細(xì)胞涂片上的免疫細(xì)胞化學(xué)染色(DAB顯色)Figure 3 Immunocytochemical staining of tumor cells based on conventional cell smears (DAB staining)

圖4 基于液基薄層細(xì)胞涂片上的免疫細(xì)胞化學(xué)染色(DAB顯色)Figure 4 Immunocytochemical staining of tumor cells based on liquid-based thin-layer cell smears (DAB)

2.3 不同方法檢測結(jié)果比較

統(tǒng)計107例胸腹水樣本的細(xì)胞學(xué)診斷結(jié)果，應(yīng)用傳統(tǒng)普通細(xì)胞涂片法確診為惡性腫瘤的12例(11.2%)，可疑陽性為16例(15.0%)，陰性的為79例；液基薄層涂片法確診惡性腫瘤為33例(30.8%)，可疑陽性為2例(1.9%)。液基薄層涂片的惡性腫瘤確診率高于傳統(tǒng)普通涂片，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05，見表1)。

3 討論

表1 胸腹水樣本不同方法檢測結(jié)果比較 (例)

Table 1 Comparison of diagnostic rate between different methods (cases)

方法n陽性可疑陽性陰性陽性確診率(%)傳統(tǒng)細(xì)胞學(xué)涂片法10712167911．2液基薄層細(xì)胞涂片法1073327230．8?

與傳統(tǒng)細(xì)胞學(xué)涂片法比較，*P<0.01

胸腹水是一種比較容易得到的標(biāo)本，標(biāo)本采集創(chuàng)傷小、操作簡單[3]。胸腹水檢測多采用直接涂片法，方法簡便、快速，在臨床上應(yīng)用比較廣泛。但應(yīng)用這種傳統(tǒng)的方法制作出來的細(xì)胞涂片常常會出現(xiàn)大量紅細(xì)胞、炎性滲出物及黏液混雜在一起，造成背景不清晰；同時易受到人為因素的影響而出現(xiàn)細(xì)胞薄厚不均勻、細(xì)胞多層重疊較為嚴(yán)重、有些陽性細(xì)胞甚至被干擾物所覆蓋、細(xì)胞結(jié)構(gòu)不清等情況，增加了閱片難度，給病理診斷帶來很大的影響[4]。液基薄層細(xì)胞技術(shù)現(xiàn)在主要用于女性宮頸癌篩查，與傳統(tǒng)脫落細(xì)胞學(xué)直接涂片法比較，具有薄層、背景清晰、面積小、血液成分少、利于顯微鏡觀察等優(yōu)點，隨著該技術(shù)的不斷完善，目前已開始嘗試應(yīng)用于其他非婦科標(biāo)本的制備。應(yīng)用液基薄層細(xì)胞技術(shù)制作胸腹水細(xì)胞涂片的方法簡單、快捷，其重復(fù)性也比較滿意，收集一次胸腹水標(biāo)本, 可以制出多張類似的超薄涂片[5]。液基試劑盒中所用的固定液含有去除紅細(xì)胞成分，應(yīng)用這種固定液固定后，所制作的胸腹水涂片中紅細(xì)胞和紅細(xì)胞碎片較少，其他種類的細(xì)胞固定充分，應(yīng)用蘇木素伊紅染色后，細(xì)胞的結(jié)構(gòu)完整，染色鮮艷，核漿對比清晰，細(xì)胞無收縮，無紅細(xì)胞干擾，背景清晰。液基固定液能夠較好地保留細(xì)胞抗原成分，為需要應(yīng)用免疫細(xì)胞化學(xué)染色進(jìn)行鑒別診斷的病例提供了條件。

免疫細(xì)胞化學(xué)染色技術(shù)的特色是把結(jié)構(gòu)和功能結(jié)合起來，有效地分析細(xì)胞的化學(xué)成分，其敏感性和特異性較高[6]。以往也有很多人對細(xì)胞免疫細(xì)胞化學(xué)染色技術(shù)進(jìn)行探討，結(jié)果都不是令人特別滿意，主要問題是陽性信號定位不夠準(zhǔn)確，特別是陽性信號定位于細(xì)胞核的抗體效果最不理想。我們經(jīng)過研究發(fā)現(xiàn)，細(xì)胞涂片中的細(xì)胞經(jīng)過固定后猶如一個荷包蛋，細(xì)胞核的表層有較完整的細(xì)胞膜覆蓋，所以細(xì)胞膜表達(dá)的抗體會在細(xì)胞核所在的位置上著色。由于細(xì)胞膜的存在，使抗體不容易透過細(xì)胞膜與細(xì)胞核中的抗原成分充分接觸，從而導(dǎo)致定位于細(xì)胞核的抗體陽性表達(dá)太弱，效果不能令人滿意。筆者進(jìn)行多次試驗和摸索，應(yīng)用酸性亞硫酸鈉和熱力學(xué)作用對細(xì)胞膜進(jìn)行處理，可以增加細(xì)胞膜的通透性，再利用1%的蛋白酶K在37 ℃的條件下消化9 min，這樣剛好可以去除覆蓋在細(xì)胞核上的一層細(xì)胞膜與細(xì)胞質(zhì)，同時又不影響細(xì)胞周邊的細(xì)胞膜應(yīng)有的表達(dá)。應(yīng)用上述這種方法對胸腹水的液基薄層涂片進(jìn)行免疫細(xì)胞化學(xué)染色，取得了很好的效果，背景干凈，陽性信號定位準(zhǔn)確，為臨床病理診斷提供了可靠的技術(shù)手段。

液基薄層涂片制作簡單，快捷，特別適用于胸腹水中細(xì)胞量較少而無法進(jìn)行制作細(xì)胞塊的病例[7]。臨床上有很多不適于手術(shù)和活檢的腫瘤患者，可以應(yīng)用這種方法制作液基薄層涂片，還可以對涂片上的脫落細(xì)胞進(jìn)行免疫細(xì)胞化學(xué)染色標(biāo)記，以明確其腫瘤的性質(zhì)、類型以及原發(fā)灶，從而指導(dǎo)臨床對患者進(jìn)行放、化療。液基薄層涂片在胸腹水中的應(yīng)用可以解決過去細(xì)胞學(xué)上存在的諸多難題，能夠大大地提高胸腹水脫落細(xì)胞學(xué)檢測的陽性率，從而具有很大的推廣和應(yīng)用前景。

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Application value of liquid-based cytology smear in diagnosis of pleural effusion and ascites

YU Le, MENG Jiarong*, ZHU Qigan, YANG Limin, WEN Lusheng, KUI Guoju, PAN Xianxin

(DepartmentofPathology, 175thHospitalofPLA,DongnanAffiliatedHospitalofXiamenUniversity,Zhangzhou363000,China;*Correspondingauthor,E-mail:mengjiarong@sina.com)

ObjectiveTo explore the value of thinprep cytologic test in the diagnosis of hydrothorax and ascites.MethodsTotally 107 samples of suspected positive pleural effusion ascites were selected and analyzed by the liquid based thin-layer cell smear and conventional cell smears, respectively. If necessary, immunocytochemical staining was used. The smear quality and the diagnostic rate of malignant tumors were compared between the two methods.ResultsThe results of cell smears and immunocytochemical staining were better than that of traditional smears. The diagnostic rate of malignant tumor was 30.8% by ThinPrep cytology, which was higher than that of the traditional cell smear method(11.2%，P<0.05).ConclusionThinprep cytology test can improve the diagnosis rate of malignant tumor in pleural effusion and ascites, with better smear quality and staining effect than conventional smear method.

hydrothorax; ascites; cytology; immunocytochemistry

禹樂，男， 1984-07生，在讀碩士，主管技師，E-mail：422245066@qq.com

2016-07-08

R446

A

1007-6611(2017)02-0149-04

10.13753/j.issn.1007-6611.2017.02.012