食管鱗癌組織中Slug、Vimentin、E-cadherin與血管生成擬態的表達及意義

周芳芳, 陳 冰

(皖南醫學院病理學教研室,蕪湖 241000; *通訊作者,E-mail:281993214@qq.com)

食管鱗癌組織中Slug、Vimentin、E-cadherin與血管生成擬態的表達及意義

周芳芳, 陳 冰*

(皖南醫學院病理學教研室,蕪湖 241000;*通訊作者,E-mail:281993214@qq.com)

目的 觀察食管鱗癌(human esophageal squamous cell carcinoma,ESCC)組織中上皮間質轉化(epithelial mesenchymal transitions,EMT)相關蛋白鋅指轉錄因子snail2(Slug)、E-鈣黏附蛋白(E-cadherin)和波形蛋白(Vimentin)與血管生成擬態(vasculogenic mimicry,VM)的表達,并探討其臨床意義。 方法 收集120例ESCC組織采用CD34/PAS套染檢測VM情況;免疫組化法檢測Slug、血管內皮鈣黏蛋白(vascular endothelial cadherin,VE-cadherin)、血管內皮生長因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)和Vimentin,E-cadherin表達。 結果 在120例ESCC中Slug的陽性表達與ESCC患者年齡、性別無關(P>0.05),但與分化程度、淋巴結轉移、臨床分期、脈管癌栓形成等有關(P<0.05);Slug,Vimentin在有VM組陽性表達率明顯高于無VM組(P<0.05),且均與VM表達呈正相關(r=0.473、0.396);E-cadherin在有VM組陽性表達率明顯低于無VM組(P<0.05),與VM表達呈負相關(r=-0.191);VE-cadherin,VEGF在Slug陽性組的陽性表達率明顯高于Slug陰性組(P<0.05),兩者均與Slug表達呈正相關(r=0.405，0.445)。 結論 Slug調控的上皮間質轉化可能參與了食管鱗癌中血管生成擬態形成過程,另外Slug的高表達可能提示ESCC患者的不良預后。

Slug; 波形蛋白; E-鈣黏蛋白; 血管生成擬態; 上皮間質轉化; 食管鱗癌

血管生成擬態(vasculogenic mimicry,VM)是一種不依賴于內皮細胞的腫瘤新生血管,是近年來腫瘤血管的研究熱點,其在缺氧環境下由HIF-1α[1]誘導VEGF[2]、VE-cadherin[3]等分子的經典信號通路的相關機制已經成熟,但有研究發現,COX-2[4]、TFPI-2[5]、小分子核酸[6]、Mig-7[7]等均參與了血管生成擬態的形成,證實了血管生成擬態的形成機制可能是非常復雜的多信號調控的多條通路的過程;另外在研究血管生成擬態形成過程中發現腫瘤細胞是通過自身變形和細胞外基質重塑構成血管樣結構,因此推測腫瘤細胞可能是通過EMT過程來實現腫瘤細胞的變形從而形成VM,Slug是鋅指蛋白家族中成員之一,參與調控多種惡性腫瘤的EMT過程。

本研究通過免疫組織化學法檢測食管鱗癌中Slug及EMT相關分子Vimentin、E-cadherin的表達,并結合臨床病理特征和分析Slug、EMT相關分子Vimentin、E-cadherin與VM之間的相關性,初步探討Slug調控的EMT在食管鱗癌中VM形成過程中發揮的作用,旨在為研究VM形成機制和臨床ESCC抗血管治療提供新思路。

1 材料和方法

1.1 臨床資料

1.1.1 病例來源及特征 收集2012-06～2014-06皖南醫學院附屬弋磯山醫院食管鱗癌手術切除標本120例,其中男性患者96例,占80%;女性患者24例,占20%;年齡為42-77歲,平均(60.3±7.5)歲;所有患者術前均做過活檢,無家族史,術后經由3位長期從事病理診斷的高年資醫師確診為食管鱗癌,手術前均無放化療史。

1.1.2 組織學分級和臨床分期 根據腫瘤的分化程度組織學分級:高分化31例,中分化70例,低分化19例;根據腫瘤浸潤食管深度分為:浸潤至黏膜層及淺肌層68例,深肌層及外膜層52例;淋巴結轉移者41例,無轉移者79例;有脈管癌栓形成47例,無脈管癌栓形成73例;根據TNM分期進行臨床分期:Ⅰ-Ⅱ期70例,Ⅲ-Ⅳ期50例。

1.2 主要試劑

抗體Slug和VE-cadherin均購自Lifespan Bioscience公司,抗體CD34、VEGF、E-Cadherin以及Vimentin均購自北京中杉金橋生物技術有限公司;DAB顯色試劑盒和二抗試劑盒均購自福州邁新公司,PAS染色試劑盒購自貝索生物公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 CD34/PAS雙重染色法觀察食管鱗癌VM ①根據免疫組化SP法,將抗體CD34免疫組化步驟到DAB顯色反應,鏡下觀察到血管內皮著色后,水流沖洗1 min終止顯色反應。②0.5%高碘酸1滴,還原10 min,水流沖洗10min。③Schiff試劑1滴,切片放于避光濕盒,置于37 ℃孵箱反應20 min,待目測組織變紅色終止反應,細流水水沖洗20 min。④蘇木素復染細胞核2 min。⑤50 ℃溫水返藍1 min,常規脫水,封片。PAS染色陽性對照為正常胃黏膜呈櫻桃紅色。

1.3.2 血管擬態(VM)評定方法 應用CD34/PAS套染后顯微鏡觀察到由腫瘤細胞構成的管腔樣結構,且管壁見不到內皮細胞、腔內可見紅細胞或無紅細胞、管壁全部或部分PAS陽性、免疫組化CD34(-)的均可判定為VM;不論管腔內有無紅細胞,管壁出現CD34(+)的血管,均判定為內皮依賴性血管。血管擬態的評定由三位長期從事病理診斷的高年資醫師盲法讀片。

1.3.3 免疫組化染色及結果判定 實驗用已知陽性作為對照,陰性對照中PBS代替一抗。免疫組化結果判定標準:Slug陽性是細胞核中出現黃色或棕黃色顆粒,E-cadherin和VE-cadherin陽性是細胞膜/漿中出現黃色或棕黃色顆粒,VEGF陽性是細胞質中出現黃色或棕黃色顆粒。Vimentin陽性是在腫瘤細胞中出現黃色或棕黃色顆粒,不論胞質還是胞核,另外其間質中也陽性表達。

對實驗指標的陽性表達從兩方面進行半定量判斷,染色強度積分:0分陰性,1分淡黃,2分深黃,3分棕色。染色范圍積分:每例標本選擇含有陽性細胞的高倍視野(×400)5個,每個高倍視野計數100個腫瘤細胞及陽性細胞的個數,計算平均陽性細胞百分比,0分陽性細胞≤10%,1分陽性細胞10%-30%,2分陽性細胞30%-70%,3分陽性細胞≥70%。將兩項積分相乘得出總積分,<3分為陰性,≥3分為陽性。

1.4 統計學方法

本實驗所有相關數據均輸入SPSS22.0進行統計學分析,各指標在兩組之間陽性表達率的比較:采用四格表χ2檢驗,當理論值較小時,采用校正四格表χ2檢驗;兩組數據之間的相關性采用Spearman相關分析;以P<0.05作為檢驗標準。

2 結果

2.1 Slug的表達與食管鱗癌的轉移和預后相關

本研究120例食管鱗癌中Slug陽性病例為43例(35.8%)(見圖1A),Slug陰性病例為77例(64.2%)。其中高分化組Slug陽性表達率為29.0%,中分化組Slug陽性表達率為28.6%,低分化組Slug陽性表達率為73.7%,組間表達差異有統計學意義(P<0.05,見表1);Slug在不同浸潤程度間表達有差異,浸潤至深肌層至外膜組Slug表達明顯高于黏膜至淺肌層(P<0.05,見表1);Slug陽性表達在淋巴結轉移組和無淋巴結轉移組有差異(P<0.05,見表1);臨床分期Ⅰ-Ⅱ期Slug陽性表達率為24.2%,Ⅲ-Ⅳ期Slug陽性表達率為52.0%,組間表達有統計學差異(P<0.05,見表1);Slug陽性表達在癌栓組和無癌栓組有差異(P<0.05,見表1),但Slug陽性表達在不同年齡和性別之間表達無差異(P>0.05,見表1)。

A.食管鱗癌中Slug的陽性表達;B.食管鱗癌中內皮性血管和VM,其中細箭頭所指為內皮性血管,CD34(+),粗箭頭所指為VM,CD34(-);C.食管鱗癌中VE-cadherin的陽性表達;D.食管鱗癌中的VEGF陽性表達;E.食管鱗癌中E-cadherin的陽性表達;F.食管鱗癌中Vimentin的陽性表達圖1 食管鱗癌組織中Slug,VM,VE-cadherin,VEGF,E-cadherin和Vimentin的表達Figure 1 The expression of Slug,VM,VE-cadherin,VEGF,E-cadherin and Vimentin in esophageal squamous cell carcinoma

表1 Slug蛋白在食管鱗癌中的表達情況及其臨床病理參數的關系

Table 1 The expression of Slug protein in ESCC and its relationship with clinicopathological parameters

臨床病理參數nSlug(+)Slug(-)χ2P性別2．9360．087 男963858 女24519年齡2．0980．147 ≥50歲852758 <50歲351619浸潤深度5．9830．014 黏膜至淺肌層681850 深肌層至外膜522527淋巴結轉移8．6060．003 有412219 無792158臨床分期9．7430．002 Ⅰ、Ⅱ701753 Ⅲ、Ⅳ502624分化程度14．0680．001 高分化31922 中分化702050 低分化19145脈管癌栓18．9390．000 有472819 無731558

2.2 CD34/PAS雙重染色法證實食管鱗癌中存在VM現象

在本研究120例食管鱗癌臨床病例標本中,有25例(25/120,24%)具有典型的VM結構(見圖1B)。

2.3 Slug的表達與VM的關系

在本研究中有25例標本中存在VM現象,有VM組Slug表達明顯高于無VM組,并且兩者成正相關(見表2)。另外,VE-cadherin和VEGF在Slug陽性組表達陽性均強于Slug陰性組,并且在食管鱗癌中Slug陽性表達與VE-cadherin和VEGF的陽性表達均呈正相關(見圖1C、1D,表2)。

2.4 Slug與E-cadherin、Vimentin之間的關系

本研究中E-cadherin陽性表達70例,E-cadherin在Slug陽性組和陰性組表達分別為34.9%和71.4%,差異具有統計學意義。相關性分析表明兩者呈負相關(r=-0.355,P=0.000,見圖1E)。Vimentin陽性表達28例,Vimentin在Slug陽性組和陰性組表達分別為53.5%和11.7%,差異具有統計學意義,相關性分析表明兩者呈正相關(r=0.533,P=0.000,見圖1F和表3)。

2.5 VM與E-cadherin、Vimentin之間的關系

本研究中,E-cadherin在有VM組表達低于無VM組,差異有統計學意義,且兩者負相關(r=-0.191,P=0.037)。Vimentin在有VM組高于無VM組,差異有統計學意義,且兩者正相關(r=0.396,P=0.000,見表4)。

表2 食管鱗癌中Slug蛋白表達及其與VM,VE-cadherin和VEGF的關系

Table 2 The expression of Slug protein in ESCC and its relationship with vasculogenic mimicry(VM),VE-cadherin and VEGF

SlugVMVE?cadherinVEGF有無rP+-rP+-rP+20230．4730．00029140．4050．0003580．4450．000-57220572750

表3 食管鱗癌中Slug蛋白表達及其與E-cadherin,Vimentin的關系

Table 3 The expression of Slug protein in ESCC and its relationship with E-cadherin and Vimentin

SlugE?cadherinVimentin+-rP+-rP+1528-0．3550．00023200．5330．000-5522572

表4 食管鱗癌中VM表達及其與E-cadherin,Vimentin的關系

Table 4 The expression of VM in ESCC and its relationship with E-cadherin and Vimentin

VME?cadherinVimentin+-rP+-rP+1015-0．191 0．03714110．3960．000-60351481

3 討論

食管鱗狀細胞癌是消化系統的常見惡性腫瘤之一,由于其早期癥狀不明顯,并且易局部浸潤和轉移,因此其死亡率較高。腫瘤的局部浸潤和轉移大多數情況下與腫瘤的血管生成關系密切。在20世紀70年代Folkman等[8]提出了血管依賴性生長腫瘤的概念后,關于腫瘤血管生成的影響因素和機制便成為了腫瘤研究的熱點之一;其目的是為了向臨床提供抗腫瘤血管生成治療。但長期以來抗血管生成效果并不佳,甚至在部分臨床研究中這一治療方式反而能促進腫瘤血管生成[9]。直到腫瘤“血管生成擬態”[10]模式的提出,人們才意識到腫瘤中還存在著一種不依賴于內皮細胞的全新的腫瘤血液供應模式。血管生成擬態形成的三個中心環節是腫瘤細胞模擬內皮細胞變形、基質重塑、VM與內皮性血管相通;那么上皮來源的腫瘤細胞如何能夠向間充質來源的內皮細胞分化,形成VM管道樣結構?由缺氧誘導的VM的經典形成通路并不能很好地解釋這一過程。

而上皮間質轉化是指上皮細胞向間質細胞轉變從而形成間充質細胞的過程,往往有上皮細胞標志物的下調和間質細胞標志物的上調以及上皮細胞獲得遷移或者侵襲力增強的功能性改變,且這個過程具有暫時性和可逆性等特點[11]。

由于VM形成過程和EMT之間存在相似性,因此我們推測上皮來源的腫瘤細胞可能通過EMT向間充質來源的內皮細胞分化,模擬內皮細胞的形態和功能,從而形成VM。因此研究誘導EMT形成的重要核轉錄因子Twist、Slug、ZEB與VM形成的關鍵分子之間的關系,有助于進一步完善上皮來源的腫瘤中VM形成的機制。

Slug屬于Snail基因超家族,這是一類具有鋅指結構的轉錄因子家族,在多種惡性腫瘤中Slug能夠促進轉移與浸潤;本實驗結果也同樣顯示,Slug的陽性表達與年齡、性別無關,但與淋巴結轉移、癌栓形成、臨床分期、分化程度等有關;提示其參與食管鱗癌的轉移與浸潤。Slug、Twist、ZEB是調控EMT的三大重要核轉錄因子,研究表明[12-14],上調Twist、ZEB-1等,可以在VM形成中發揮關鍵作用,Sun等[12]發現,通過調控肝癌細胞的Twist的表達可以影響肝癌VM形成能力,兩者呈正相關;Liu等[13]研究發現,在直腸癌中調控ZEB-1同樣在促進VM形成,Yang等[14]在肝癌中發現ZEB-2促進VM形成。然而,Slug與食管鱗癌VM之間的關系目前尚不清楚,本研究結果顯示,食管鱗狀細胞癌中存在VM組的Slug的陽性表達率顯著高于不存在VM組(r=0.473,P<0.05);并且Slug陽性組VE-cadherin、VEGF的表達均明顯強于Slug陰性組(r=0.405,0.445,P<0.05);而VE-cadherin、VEGF是公認的VM形成的關鍵性因子,這些結果均提示Slug與食管鱗癌VM形成關系密切。

EMT是胚胎時期的一個正常發育過程,其標志性表現為上皮標志物E-cadherin的下降和間質標志物Vimentin的上調;當EMT發生于惡性腫瘤過程時往往可促進腫瘤細胞的浸潤和轉移,本研究結果顯示E-cadherin、Vimentin在食管鱗癌VM(+)組和VM(-)組之間表達有差異(P<0.05),VM與E-cadherin的表達呈負相關,而與Vimentin呈正相關,這提示在食管鱗癌VM中有EMT的發生。

另外本研究中食管鱗癌Slug的表達與Vimentin呈正相關,與E-cadherin呈負相關,這些結果均提示Slug蛋白可能通過抑制上皮細胞標記E-cadherin的表達,促進間葉細胞標記Vimentin表達[15,16],誘導EMT的發生使腫瘤細胞之間的黏附性下降,利于腫瘤細胞的自身變形,從而促進食管鱗癌VM的形成。

綜上所述,Slug蛋白誘導的EMT可能參與食管鱗癌的VM形成,從而促進食管鱗癌的轉移和浸潤,但具體機制目前還不是很清楚,有可能是通過抑制E-cadherin表達和促進Vimentin表達,這將是今后研究的重點,另外希望研究可以為臨床的抗腫瘤血管治療提供一些新的指導。

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Expression of Slug,Vimentin,E-cadherin and vasculogenic mimicry in esophageal squamous cell carcinoma and its clinical significance

ZHOU Fangfang, CHEN Bing*

(DepartmentofPathology,WannanMedicalCollege,Wuhu241000,China;*Correspondingauthor,E-mail:281993214@qq.com)

ObjectiveTo study the expression of Slug,Vimentin,E-cadherin and vasculogenic mimicry in esophageal squamous cell carcinoma and its clinical significance.MethodsDual staining of CD34 and periodic acid-schiff(PAS) was performed to validate the existence of vasculogenic mimicry in human esophageal squamous cell carcinoma(ESCC). Immunohistochemical method was used to detect the expression of Slug,VE-cadherin,VEGF,Vimentin,E-cadherin in 120 case of ESCC.ResultsThe positive rate of Slug was correlated with differentiation,lymph node metastsis, cancer embolus and clinical stage(P<0.05),but not with age and gender(P>0.05). The expression of Slug and Vimentin in positive VM group was significantly higher than in negative VM group(P<0.05),and the expression of Slug and Vimentin was positively correlated with VM in ESCC(r=0.473,0.396).The expression of E-cadherin in positive VM group was lower than in negative VM group(P<0.05),and the expression of E-cadherin was negatively correlated with VM in ESCC(r=-0.191).The expression of VE-cadherin,VEGF in positive Slug group was obviously higher than that in negative Slug group(P<0.05),and the levels of VE-cadherin and VEGF expression were positively correlated with Slug in ESCC(r=0.405,0.445).ConclusionThe epithelial mesenchymal transitions regulated by Slug may promote VM formation in ESCC.High expression of Slug may indicate the poor prognosis of ESCC patients.

Slug; Vimentin; E-cadherin; vasculogenic mimicry; epithelial mesenchymal transitions; esophageal squamous cell carcinoma

皖南醫學院校級中青年基金資助項目(WK201316)

周芳芳,女,1983-06生,碩士,助教,E-mail:379583530@qq.com

2016-11-09

R735.1

A

1007-6611(2017)02-0144-05

10.13753/j.issn.1007-6611.2017.02.011