青蒿素通過抑制JAK2/STAT3信號通路誘導肝癌細胞凋亡

郭佳培， 郭 彬， 李雷雷， 劉殿星， 石 峻， 吳景華

(華北理工大學附屬醫院檢驗科，唐山 063000; *通訊作者,E-mail：tswujinghua@163.com)

青蒿素通過抑制JAK2/STAT3信號通路誘導肝癌細胞凋亡

郭佳培， 郭 彬， 李雷雷， 劉殿星， 石 峻， 吳景華*

(華北理工大學附屬醫院檢驗科，唐山 063000;*通訊作者,E-mail：tswujinghua@163.com)

目的 研究青蒿素對肝癌細胞中JAK2/STAT3信號通路活化的影響，探討青蒿素抗腫瘤的相關機制。 方法 選擇15只6-8周齡的C57BL/6J小鼠，采用二乙基亞硝胺(diethylnitrosamine,DEN)腹腔注射和CCl4灌胃方法構建小鼠肝癌模型，隨機分為PBS組、青蒿素組和青蒿素+pJAK2多肽組，另選5只正常小鼠作為空白組。PBS組和青蒿素組分別腹腔注射PBS及青蒿素(100 mg/kg)，隔日作用，3周后處死小鼠；青蒿素+pJAK2多肽組應用pJAK2多肽[100 μmol/(L·kg)]隔日作用3次后，再聯合青蒿素隔日作用3周，處死小鼠；分離腫瘤組織，Western blot檢測腫瘤組織Caspase 3的表達，免疫熒光檢測組織中p-JAK2及p-STAT3的表達。 結果 成功構建小鼠肝癌模型，荷瘤小鼠經青蒿素作用后腫瘤組織Caspase 3蛋白表達顯著增加(P<0.001)。同時免疫熒光結果顯示青蒿素組腫瘤組織中的p-JAK2及p-STAT3磷酸化水平較之PBS組明顯降低；荷瘤小鼠經pJAK2多肽預處理后，青蒿素誘導荷瘤小鼠表達Caspase 3顯著降低(P<0.05)，差異有統計學意義。 結論 青蒿素通過抑制JAK2/STAT3信號通路活化誘導肝癌細胞凋亡，進而發揮抗腫瘤作用。

肝癌； 青蒿素； JAK2/STAT3； 細胞凋亡

肝癌(hepatocellular carcinoma，HCC)是常見惡性腫瘤之一，其發病率逐年增高，病死率在腫瘤中位居第二[1]。由于其起病隱匿和進展迅速等特點，多數患者確診時已是中晚期。因此，化療成為常用的治療手段。然而細胞毒性藥物化療效果往往不理想，并且對正常細胞也有一定的毒副作用[2]，因此中晚期肝癌的治療方式仍有待進一步拓展與改善。青蒿素是1971年由中國首次從黃花蒿葉中提取的倍半萜內酯類化合物，因其抗瘧性強、毒性低，為治療瘧疾的首選藥物。目前有研究表明，青蒿素具有抗腫瘤細胞活性和抑制腫瘤的作用，可以誘導肝癌細胞凋亡[3]，本實驗對青蒿素抗腫瘤作用進行深入觀察與分析，探究青蒿素誘導肝癌凋亡的機制。

1 材料與方法

1.1 主要試劑與儀器

青蒿素注射液(廣州漢方現代中藥研究有限公司，批號100651)，anti-p-JAK2抗體(美國，CST)，anti-p-STAT3抗體(美國，CST)，anti-Caspase 3抗體(美國，CST)，p-JAK2多肽(上海，吉爾生化)，FITC-anti-IgG(中國，碧云天)，TRITC-anti-IgG(中國，碧云天)，蛋白電泳儀(Bio-rad，美國)，Image Lab凝膠成像分析系統(Bio-rad，美國)，免疫熒光顯微鏡(日本，奧林巴斯)。

1.2 小鼠肝癌模型構建

選擇SPF級C57BL/6J小鼠20只(華北理工大學實驗動物中心SPF級環境飼養，生產許可證號：SCXK(軍) 2014-0001)，6-8周齡，體質量23-28 g。隨機分為空白組、PBS組、青蒿素組、青蒿素+pJAK2多肽組，每組5只。其中PBS組、青蒿素組、青蒿素+pJAK2多肽組小鼠構建肝癌模型。三組小鼠在適宜的相同環境中飼養6 d，小鼠腹腔注射100 mg/kg的二乙基亞硝胺(diethylnitrosamine,DEN)，小鼠腹腔注射3 d后，以5 ml/kg的CCl4和橄欖油(按20 ∶80的體積之比)灌胃，2次/周，第3周給予DEN 50 mg/kg腹腔注射1次，同時給予含9%乙醇飲用水，第4周開始加大CCl4劑量至8 ml/kg灌胃至18周，對荷瘤小鼠進行藥物干預。

1.3 荷瘤小鼠的藥物干預

空白組5只小鼠正常飼養，不做處理。取構建好的荷瘤小鼠進行藥物干預：PBS組及青蒿素組分別腹腔注射PBS及青蒿素(100 mg/kg)，隔日1次，連續作用3周，實驗結束處死小鼠，分離腫瘤組織。p-JAK2多肽+青蒿素組腹腔注射p-JAK2多肽[100 μmol/(L·kg)]，隔日注射一次，注射3次后，再用青蒿素(100 mg/kg)聯合p-JAK2多肽[10 μmol/(L·kg)]作用，隔日1次，連續作用3周，處死小鼠，分離小鼠的腫瘤組織。

1.4 免疫熒光組織化學檢測JAK2/STAT3的活化

將上述方法分離的各組小鼠的部分腫瘤組織，冰凍切片，加一抗4 ℃過夜，熒光標記的二抗37 ℃作用1 h，熒光顯微鏡觀察腫瘤組織中JAK2和STAT3的活化情況。實驗平行重復3次。

1.5 Western blot檢測腫瘤組織中Caspase 3和P53的表達

提取上述方法分離的各組小鼠的部分腫瘤組織中的蛋白，用10%聚丙烯酰胺凝膠進行電泳，加一抗4 ℃過夜，二抗37 ℃作用1 h，應用Image Lab凝膠成像系統檢測腫瘤組織中Caspase 3和P53的表達水平。實驗平行重復3次。

1.6 統計學分析

2 結果

2.1 青蒿素誘導荷瘤小鼠肝癌組織凋亡情況

成功構建小鼠模型，分離腫瘤組織并提取蛋白，Western blot結果顯示，荷瘤小鼠經青蒿素作用后，凋亡蛋白Caspase3表達較空白組及PBS組顯著升高(見表1，圖1)。

組別 Caspase3FP空白組142．637<0．001PBS組0．86±0．08青蒿素組2．53±0．20?

與空白組和PBS組相比，*P<0.001

1.空白組;2.PBS組;3.青蒿素組 圖1 青蒿素誘導腫瘤組織細胞凋亡情況Figure 1 Apoptosis induced by artemisinin in tumor tissues

2.2 青蒿素抑制肝癌組織JAK2/STAT3信號通路的活化情況

通過免疫熒光檢測發現，荷瘤小鼠JAK2的磷酸化水平(p-JAK2)及STAT3磷酸化水平(p-STAT3)較之空白組明顯升高，同時經青蒿素作用后，荷瘤小鼠JAK2和STAT3磷酸化水平又顯著降低(見圖2)。結果提示，青蒿素可以抑制腫瘤組織JAK2，STAT3的磷酸化激活。

圖2 免疫熒光檢測腫瘤組織JAK2/STAT3的活化情況 (×400)Figure 2 The activation of JAK2/STAT3 in tumor tissues by immunofluorescence histochemistry (×400)

2.3 青蒿素通過JAK2/STAT3通路誘導肝癌細胞凋亡情況

為了進一步驗證青蒿素通過活化JAK2/STAT3信號通路對腫瘤凋亡的影響，加入了pJAK2多肽。Western blot結果顯示，加入pJAK2多肽后肝癌細胞中的JAK2/STAT3信號通路被顯著活化(見表2，圖3A)；同時可以顯著降低腫瘤的凋亡蛋白Caspase3的表達(見表3，圖3B)。結果進一步證明了青蒿素通過抑制JAK2/STAT3信號通路抑制細胞的凋亡。

組別p?JAK2p?STAT3PBS組11P?JAK2多肽組3．48±0．672．51±0．51 t6．4455．134 P0．0030．007

組別Caspase3FP空白組176．531<0．001PBS組0．94±0．30青蒿素組3．67±0．52?pJAK2多肽+青蒿素組1．17±0．53

與其他三組相比，*P<0.05

圖3 pJAK2多肽激活JAK2/STAT3后細胞的凋亡情況Figure 3 Apoptosis after JAK2/STAT3 activation induced by pJAK2 polypeptide

3 討論

肝癌是我國常見的惡性腫瘤之一，病死率極高。目前，治療肝癌的化療藥物主要是以細胞毒性藥物為主。細胞毒性藥物不僅殺死肝癌細胞，而且正常的肝細胞也受到損害。因此，尋找治療效果好、毒副作用小的抗肝癌藥物成為研究熱點。青蒿素是我國首次發現的，具有很強的抗瘧活性的藥物。近年來又發現青蒿素類藥物具有較強的抗腫瘤作用[4]。研究發現，青蒿素作用荷瘤小鼠后，可以使荷瘤小鼠腫瘤得到顯著抑制，同時小鼠的生存時間可以明顯延長[5]。本研究成功構建小鼠肝癌模型，通過青蒿素作用荷瘤小鼠后發現，小鼠腫瘤組織的凋亡顯著增加。因此，我們認為肝癌細胞對青蒿素具有良好的凋亡敏感性。

JAK2/STAT3信號通路是細胞因子激活相關的信號轉導通路，主要參與細胞增殖、分化、凋亡以及免疫調節等過程。越來越多的研究發現JAK/STAT信號通路在多種腫瘤組織中被異常激活而高表達[6]。研究發現，JAK/STAT3 信號通路在多種肝癌細胞系中均有異常活化[7]。JAK/STAT 信號通路過度活化在肝細胞性肝癌的發生和發展過程中起重要作用，并作為評價肝細胞性肝癌惡性程度及預后的重要生物學指標[8]。為了驗證青蒿素誘導肝癌細胞凋亡是否與JAK2/STAT3信號通路有關聯，青蒿素作用后JAK2/STAT3的表達情況首先被檢測，結果證明青蒿素可以顯著抑制JAK2/STAT3的活化。那么，青蒿素的這種抑制作用是否就是其誘導凋亡的機制呢？pJAK2多肽激活JAK2/STAT3信號通路使結果得到進一步驗證。當JAK2/STAT3信號通路被持續激活后，青蒿素抑制JAK2/STAT3信號活化被阻斷，結果顯示青蒿素誘導的凋亡作用被明顯的抑制，因此我們認為青蒿素主要通過抑制JAK2/STAT3信號通路的活化來發揮抗腫瘤作用。

綜上所述，青蒿素抗肝癌細胞活性主要通過抑制JAK2/STAT3信號活化發揮作用，進一步拓寬了對青蒿素抗腫瘤的認識，為增強其抗腫瘤活性提供了基礎。

[1] Zhao Y,Wang Q,Deng X,etal.Quantitative assessment of the association between GSTP1 gene Ile105Val polymorphism and susceptibility to hepatocellular carcinoma[J].Tumor Biol,2013,34(4):2121-2126.

[2] 鄭紹琴,劉亞軍,宋健平,等.青蒿素對小鼠Lewis肺癌的抑制及TNF-α和IFN-γ的影響[J].江西中醫藥,2014,45(9):20-23.

[3] 盛慶壽,王武,郭洪武.雙氫青蒿素對原發性肝癌大鼠的治療作用及機制[J].中國實驗方劑學雜志,2014,20(14):150-154.

[4] 張宇祥,呼彩蓮,張彩蓮.雙氫青蒿素對肺癌抑制作用的研究進展[J].當代醫學,2008,14(1):35-36.

[5] 萬成亮,蔣永新,寸英麗,等.蒿甲醚與順鉑聯用對Lewis肺癌小鼠的抑瘤作用及其機制探討[J].昆明醫學院學報,2011,32(3):21-26.

[6] Kowshik J,Baba AB,Giri H.Astaxanthin inhibits JAK/STAT-3 signaling to abrogate cell proliferation,invasion and angiogenesis in a hamster model of oral cancer[J].PLoS One,2014,9(10):e109114.

[7] Wei RC,Cao X,Gui JH,etal.Augmenting the antitumor effect of TRAIL by SOCS3 with double-regulated replicating oncolytic adenovirus in hepatocellular carcinoma[J].Hum Gene Ther,2011,22(9):1109-1119.

[8] 張斌,鐘德玝,王群偉,等.JAK/STAT信號通路與肝細胞性肝癌的腫瘤進展和預后的相關性研究[J].細胞與分子免疫學雜志,2010,26(4):368-370.

Effect of artemisinin inhibiting JAK2/STAT3 pathway on apoptosis of hepatocellular carcinoma cells

GUO Jiapei, GUO Bin, LI Leilei, LIU Dianxing, SHI Jun, WU Jinghua*

(DepartmentofLaboratoryMedicine,AffiliatedHospitalofNorthChinaUniversityofScienceandTechnology,Tangshan063000,China;*Correspondingauthor,E-mail：tswujinghua@163.com)

ObjectiveTo explore the anti-tumor mechanism of artemisinin by investigating effects of artemisinin on JAK2/STAT signal patway in the hepatocellular carcinoma(HCC).MethodsThe C57BL/6J HCC model mice were induced with diethylnitrosamine(DEN) injection and intragastric administration of CCl4.Fifteen HCC model mice were randomly divided into PBS group, artemisinin group and polypeptide+artemisinin group, and 5 normal mice were used as control group. The mice were intraperitoneally injected with PBS and artemisinin(100 mg/kg) for three weeks in PBS group and artemisinin group, respectively, and then the mice were killed. Mice in polypeptide+artemisinin group were killed after intraperitoneal injection of polypeptide[100 μmol/(L·kg)] every other day for one week and then treatment with artemisinin for three weeks. After tumor tissues were separated, the expression of caspase 3 in tumor tissues was detected by Western blot, and the expression of p-JAK2 and p-STAT3 was measured with immunofluorescence histochemistry.ResultsThe C57BL/6J mice of HCC models were successfully constructed. The expression of Caspase 3 was significantly increased in tumor tissues after treated with artemisinin(P<0.001), while the p-JAK2 and p-STAT3 were decreased significantly(P<0.05). Compared with artemisinin group, Caspase 3 expression was decreased significantly after preconditioning with pJAK2 in polypeptide+artemisinin group(P<0.05).ConclusionArtemisinin may play a vital role in anti-tumor by inducing the apoptosis of hepatocellular carcinoma cells through inhibiting the activation of JAK2/STAT3 signal pathway.

hepatocellular carcinoma(HCC); artemisinin; JAK2/STAT3; apoptosis

河北省自然科學基金資助項目(H2016209007)

郭佳培，女，1991-02生，在讀碩士，初級檢驗師，E-mail：806364261@qq.com

2016-11-24

R735.7

A

1007-6611(2017)02-0097-04

10.13753/j.issn.1007-6611.2017.02.001