黃芪花中主要化學(xué)成分的定性及定量分析

王桂臻, 郝 霞, 劉 磊, 李震宇, 秦雪梅,李 科*

(1山西大學(xué)中醫(yī)藥現(xiàn)代研究中心,太原 030006; 2山西大學(xué)化學(xué)化工學(xué)院; *通訊作者,E-mail: like@sxu.edu.cn)

黃芪花中主要化學(xué)成分的定性及定量分析

王桂臻1,2, 郝 霞1,2, 劉 磊1,2, 李震宇1, 秦雪梅1,李 科1*

(1山西大學(xué)中醫(yī)藥現(xiàn)代研究中心,太原 030006;2山西大學(xué)化學(xué)化工學(xué)院;*通訊作者,E-mail: like@sxu.edu.cn)

目的 對(duì)黃芪花中主要化學(xué)成分進(jìn)行定性及定量分析,為充分利用豐富的藥用植物資源提供依據(jù)。 方法 該研究采用GC-MS對(duì)黃芪花中的糖類和氨基酸類化學(xué)成分進(jìn)行分析以及采用HPLC對(duì)黃酮類、皂苷類等化學(xué)成分進(jìn)行定性及定量分析。 結(jié)果 經(jīng)測(cè)定,黃芪花中含有6種黃酮類成分、2種皂苷類成分、豐富的糖類成分和17種氨基酸成分。 結(jié)論 黃芪花中含有黃酮類、皂苷類、糖類、氨基酸類等多種有效化學(xué)成分,這可以為黃芪花的資源開(kāi)發(fā)利用提供參考依據(jù)。

黃芪花; 化學(xué)成分; 定性分析; 定量分析

黃芪為豆科植物膜莢黃芪[Astragalusmembranaceus(Fisch.)Bunge]或蒙古黃芪[A.membranaceus(Fisch.)Bunge var.mongholicus(Bunge)Hsiao]的干燥根[1],始載于《神農(nóng)本草經(jīng)》,臨床應(yīng)用非常廣泛,近年來(lái)對(duì)于黃芪的化學(xué)成分、藥理作用的研究已有大量報(bào)道[2]。黃芪在唐代《新修本草》、宋代《本草圖經(jīng)》及明代《本草綱目》均有記載,其味甘,性微溫,歸肺、脾、腎經(jīng),具有利水消腫、生肌托搭、固脫斂汗、固表益氣的功效[3]。

傳統(tǒng)蒙古黃芪為多年生草本植物,為山西恒山山脈野生或仿野生種植,一般需要生長(zhǎng)6年以上采挖,根部入藥,因此在黃芪入藥時(shí)地上部分大多被丟棄,造成大量的資源浪費(fèi)[4]。目前已有研究發(fā)現(xiàn)黃芪地上部分的主要化學(xué)成分如氨基酸類、黃酮類、皂苷類及糖類等和根部類似[5],而且其中一些化學(xué)成分含量高于傳統(tǒng)用藥部位根部[6]。對(duì)莖葉的利用會(huì)影響根的產(chǎn)量和質(zhì)量,黃芪植物從種子萌芽的第二年即每年開(kāi)花結(jié)果,資源豐富,對(duì)花和果實(shí)的采摘會(huì)減少植物的營(yíng)養(yǎng)消耗,更有利于根的生長(zhǎng)。

在我國(guó)黑龍江地區(qū),人們有食用黃芪葉和花的習(xí)慣,認(rèn)為它們也有一定的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值與療效。但目前尚未見(jiàn)有關(guān)黃芪花化學(xué)成分的全面系統(tǒng)的研究報(bào)道。因此,本課題組選取黃芪花為研究對(duì)象,對(duì)其主要化學(xué)成分進(jìn)行定性和定量分析,以期為黃芪的綜合開(kāi)發(fā)利用提供依據(jù),避免資源浪費(fèi)。

1 材料

1.1 儀器

氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀(Thermo Finnigan離子阱GC/MS);高效液相色譜儀[Waters e2695高壓泵、Waters2689紫外可見(jiàn)檢測(cè)器、蒸發(fā)光散射(Chromachem ELSD)檢測(cè)器、Empower色譜工作站];Sartorius BSA124S分析天平。真空冷凍干燥儀(寧波新芝科技有限公司TGL-16型);真空旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀RE-52A;高效液相色譜儀(依利特P230);示差檢測(cè)器(Shodex RI-201H);高速冷凍離心機(jī)(ZD-A1L);SHK-99-Ⅱ型臺(tái)式恒溫?fù)u床等。

1.2 試劑

三氟乙酸(TFA);二甲基亞砜(DMSO);1-甲基咪唑;乙酸酐;二氯甲烷;氯仿;硼氫化鈉;正己烷;吡啶;無(wú)水乙醇;正丁醇;甲醇,氯甲酸乙酯(ECF)等均為分析純,乙腈為色譜純(美國(guó)Fisher公司);娃哈哈純凈水。20種氨基酸標(biāo)品(批號(hào)為140624-201506)購(gòu)買自中國(guó)生物制品檢定所;右旋糖酐標(biāo)準(zhǔn)品(2500,4600,7100,10000,21400,41100,84400,133800)(批號(hào)為140638-140645)購(gòu)買自中國(guó)生物制品檢定所,Dextran 270000(BCBN4623V)購(gòu)自Sigma公司。DEAE-Cellulose 52購(gòu)自北京索萊寶科技有限公司。8種單糖標(biāo)準(zhǔn)品(葡萄糖、半乳糖、甘露糖、果糖、木糖、阿拉伯糖、巖藻糖、鼠李糖)與9種糖醇標(biāo)準(zhǔn)品(山梨醇、半乳糖醇、甘露醇、木糖醇、阿拉伯糖醇、巖藻糖醇、鼠李糖醇、肌醇、核糖醇)均購(gòu)自Sigma公司(批號(hào)依次為158968,G5388,M2069,F2543,1722005,605425,R3875,S1876,G0049000,M9546,X3375,L1326,G4325,43434,E3445,D3245,I5125)。1-10號(hào)對(duì)照品:毛蕊異黃酮葡萄糖苷;芒柄花素;(6aR,11aR)-9,10-二甲氧基紫檀烷-3-O-β-D-葡萄糖苷;7,2′-二羥基-3′,4′-二甲氧基異黃烷-7-O-β-D-葡萄糖苷;黃芪皂苷Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ(均購(gòu)于上海永恒生物科技有限公司,批號(hào)依次為20120428、20120528、20120515、20100202、20111125、20110503、20120411、20120315);芒柄花苷;毛蕊異黃酮(購(gòu)于成都曼斯特公司，批號(hào)依次為13021808、13082713)。

本實(shí)驗(yàn)所需植物材料為山西渾源傳統(tǒng)蒙古黃芪的花,將處于盛花期的植物花朵摘下,晾干,粉碎后置于陰涼處備用。植物樣品由山西大學(xué)秦雪梅教授鑒定,標(biāo)本保存于山西大學(xué)中醫(yī)藥現(xiàn)代研究中心。

2 方法與結(jié)果

2.1 黃芪花中黃酮與皂苷類成分測(cè)定

2.1.1 黃芪花供試品溶液的制備 參照文獻(xiàn)[7]方法,取黃芪花中粉約3.0 g,置圓底燒瓶中,加甲醇120 ml,水浴回流提取3 h,濾過(guò),回收溶劑至干,殘?jiān)蛹状既芙?定容至5 ml容量瓶中,加甲醇至刻度,搖勻,即得。

2.1.2 色譜條件 流動(dòng)相為乙腈(A)-水(B),體積流量1.0 ml/min,蒸發(fā)光檢測(cè)器參數(shù):N2壓力為156 kPa,霧化溫度為35 ℃,汽化溫度為50 ℃,增益值為5.0,Venusil MP C18色譜柱(250 mm×4.6 mm,5 μm),紫外檢測(cè)波長(zhǎng)230 nm,柱溫25 ℃,進(jìn)樣量20 μl。梯度洗脫:0-8 min,20%A;8-15 min,30%A;15-30 min,43%A;30-40 min,60%A;40-50 min,100%A;50-60 min,100%A;60-65 min,20%A。

2.1.3 混合對(duì)照品溶液的制備 10種標(biāo)準(zhǔn)品分別為毛蕊異黃酮苷,芒柄花苷,(6aR,11aR)-9,10-二甲氧基紫檀烷-3-O-β-D-葡萄糖苷,7,2′-二羥基-3′,4′-二甲氧基異黃烷-7-O-β-D-葡萄糖苷,毛蕊異黃酮,芒柄花素,黃芪皂苷Ⅳ,黃芪皂苷Ⅲ,黃芪皂苷Ⅱ,黃芪皂苷Ⅰ。分別精密稱10種對(duì)照品適量,置于10 ml容量瓶中,用甲醇溶解,搖勻,定容,分別制成935.0,680.0,681.0,601.0,522.0,627.0,979.0,250.0,582.0,986.0 μg/ml的對(duì)照品貯備液。再分別吸取適量至25 ml容量瓶中,定容,制成濃度分別為200.09,85.6,141.2,60.1,29.2,12.5,62.7,45.8,55.9,164.0 μg/ml的混合對(duì)照品溶液。

2.1.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制過(guò)程中,至少包含5個(gè)濃度梯度,將以上配制的對(duì)照品貯備液分別逐級(jí)稀釋。1號(hào)對(duì)照品,對(duì)照品濃度系列分別為原濃度的1,1/2,1/4,1/8,1/16,1/32,1/64;2,3,5,6號(hào)對(duì)照品,對(duì)照品濃度系列分別為原濃度的1/2,1/4,1/8,1/16,1/32,1/64;4號(hào)對(duì)照品,對(duì)照品濃度系列分別為原濃度的1/2,1/4,1/8,1/16,1/32;7,8號(hào)對(duì)照品,對(duì)照品濃度系列分別為原濃度的1,1/2,1/4,1/8,1/16,1/32。過(guò)0.45 μm濾膜后,進(jìn)樣20 μl。繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,得回歸方程及其線性范圍,見(jiàn)表1。

2.1.5 方法學(xué)考察

2.1.5.1 系統(tǒng)適應(yīng)性試驗(yàn)將混合對(duì)照品溶液與黃芪花供試品溶液20 μl分別注入液相色譜儀,理論塔板數(shù)以芒柄花素峰算不低于4 000,對(duì)照品溶液和樣品溶液色譜圖中的各峰之間的分離度大于1.5，見(jiàn)圖1。

2.1.5.2 精密度試驗(yàn)吸取混合對(duì)照品溶液,連續(xù)進(jìn)樣6次,以10種成分的峰面積值計(jì)。計(jì)算RSD值,結(jié)果見(jiàn)表1。

2.1.5.3 重復(fù)性試驗(yàn)精密稱取同一批黃芪樣品6份,按2.1.1項(xiàng)下方法制備供試品溶液,按2.1.2項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣分析。計(jì)算RSD值,結(jié)果見(jiàn)表1。

1.毛蕊異黃酮葡萄糖苷;2.芒柄花苷;3.(6aR, 11aR)-9,10-二甲氧基紫檀烷-3-O-β-D-葡萄糖苷;4.7,2 ′-二羥基-3′,4′-二甲氧基異黃烷-7-O-β-D-葡萄糖苷;5.毛蕊異黃酮;6.芒柄花素;7.黃芪甲苷;8.黃芪皂苷Ⅲ;9.黃芪皂苷Ⅱ;10.黃芪皂苷Ⅰ圖1 對(duì)照品及供試品的HPLC圖譜Figure 1 HPLC Chromatograms of reference substances and samples

2.1.5.4 穩(wěn)定性試驗(yàn)取同一批黃芪藥材,按2.1.1項(xiàng)下方法制備供試品溶液,分別于0,2,4,6,8,10,12,24 h后進(jìn)樣分析。計(jì)算RSD值,結(jié)果見(jiàn)表1。

2.1.5.5 加樣回收率試驗(yàn)取已知成分含量的黃芪藥材,精密稱定1.5 g,按樣品中已知成分含量的50%、100%和150%分為高中低三個(gè)組,每組三個(gè)平行樣品,一共9份樣品。每組加入一定量的對(duì)照品,按2.1.1項(xiàng)下方法制備供試品溶液,進(jìn)樣。計(jì)算RSD值,結(jié)果見(jiàn)表2。回收率計(jì)算公式如下:回收率(%)=(實(shí)測(cè)值-供試品中含有量)/加入對(duì)照品量×100%。

由表1標(biāo)準(zhǔn)品及供試品的線性回歸、精密度、重復(fù)性、穩(wěn)定性試驗(yàn)結(jié)果及表2加樣回收率實(shí)驗(yàn)結(jié)果可見(jiàn),線性回歸、精密度、重復(fù)性、穩(wěn)定性試驗(yàn)RSD均小于3%。加樣回收率實(shí)驗(yàn)中RSD小于 5%。因此,該方法穩(wěn)定性好、重復(fù)性好,可靠,可用于黃酮及皂苷的測(cè)定。

2.1.6 黃芪花中黃酮和皂苷類成分測(cè)定 按照上述方法制備黃芪花供試品溶液,并進(jìn)樣分析,按如下方法計(jì)算含量。

對(duì)黃酮類成分，對(duì)照品溶液和供試品溶液分別進(jìn)樣20 μl,測(cè)定,公式如下:M待測(cè)樣=M標(biāo)準(zhǔn)品×A待測(cè)樣/A標(biāo)準(zhǔn)品,其中,M為質(zhì)量,A為峰面積。

對(duì)皂苷類成分,將對(duì)照品溶液分別進(jìn)樣10 μl和20 μl,供試品溶液進(jìn)樣20 μl,用外標(biāo)兩點(diǎn)法測(cè)定含量,公式如下:lgA=blgM+lga,其中,M為質(zhì)量,A為峰面積,a、b為常數(shù)。

表1 黃芪花8種化學(xué)成分的線性回歸、精密度、重復(fù)性、穩(wěn)定性試驗(yàn)

Table 1 Linear equation,precision,repeatability and stability of 8 components in Astragalus flower

成分回歸方程線性范圍(μg)R2精密度RSD(%)重復(fù)性含量(mg/g)RSD(%)穩(wěn)定性RSD(%)1Y=55753 85X+547 910 298-18 71 00001 80 9941 31 92Y=53114X+635600 212-6 80 99991 50 2872 21 23Y=46359X+604420 213-6 810 99991 90 3631 11 84Y=36644X+155290 376-6 010 99911 40 0983 62 25Y=97974X-483180 163-5 221 00001 20 0212 42 76Y=98481X-268260 196-6 270 99931．00 0122 42 97y=1 59x+1 850 153-4 8950 99901．00 2342．01 18y=1 465x+2 3890 182-5 820 99901 50 1532 70 8

對(duì)于6種黃酮類成分,橫坐標(biāo)為進(jìn)樣量(X),縱坐標(biāo)為峰面積(Y);對(duì)于2種皂苷成分,以進(jìn)樣量的對(duì)數(shù)(x)為橫坐標(biāo),峰面積的對(duì)數(shù)(y)為縱坐標(biāo)

表2 回收率測(cè)定試驗(yàn) (n=6)

Table 2 The recovery test (n=6)

成分編號(hào)50%100%150%平均回收率(%)RSD(%)平均回收率(%)RSD(%)平均回收率(%)RSD(%)1100 22 499 32 897 72 02100 91 698 61 1100 52 1399 20 3102 12 299 20 54100 50 6101 31 3100 60 9599 33 099 32 8102 23 4697 14 399 92 397 23 57100 61．097 11 5101．01 3899 41 499 71 2103 12 2

實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,黃芪花中含有毛蕊異黃酮苷、芒柄花苷、紫檀烷苷、異黃酮苷、毛蕊異黃酮、芒柄花素6種黃酮類成分及黃芪皂苷Ⅳ,黃芪皂苷Ⅱ兩種皂苷類成分(見(jiàn)表3)。

表3 黃芪樣品中8種成分的含量 (n=3)

Table 3 Contents of 8 components of Astragalus samples (n=3)

編號(hào)名稱含量(mg/g)百分含量(%)1毛蕊異黃酮苷0 7270 07272芒柄花苷0 9250 09253紫檀烷苷0 0540 00544異黃酮苷0 1490 01495毛蕊異黃酮0 0420 00426芒柄花素0 0120 00127黃芪甲苷0 0740 00748黃芪皂苷Ⅱ0 0620 0062

2.2 黃芪花中多糖分子量測(cè)定

2.2.1 黃芪花粗多糖的提取 黃芪花藥材,粉碎,取中粉約5.0 g,精密稱定,置于1 000 ml圓底燒瓶中,第一次加500 ml蒸餾水,回流提取1 h,取上清。殘?jiān)屑?00 ml蒸餾水再次回流提取1 h,合并兩次提取液,旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮,定容至100 ml容量瓶中。加入無(wú)水乙醇配成含醇量80%的溶液。靜置過(guò)夜,3 000 r/min離心5 min,沉淀用90 ml蒸餾水復(fù)溶,得粗多糖溶液。

2.2.2 除去粗多糖中的蛋白質(zhì) 參照文獻(xiàn)[8]方法,將90 ml粗多糖溶液倒入150 ml錐形瓶中,加入氯仿-正丁醇(預(yù)先配制成體積比4 ∶1混合液)溶液,料液比3 ∶1,充分振搖30 min后,靜置,收集氯仿相。水相中再加入相當(dāng)于1/3水相體積的氯仿-正丁醇溶液,重復(fù)上述過(guò)程兩次。將兩次分離的氯仿相合并,加少量蒸餾水洗滌,共洗滌三次,洗滌液與水相合并,即得到粗多糖溶液,冷凍干燥,備用。

2.2.3 分離純化粗多糖 參照文獻(xiàn)[9]方法,精密稱定0.20 g粗多糖,蒸餾水溶解,DEAE-纖維素52柱色譜分離,分別用蒸餾水,0.3 mol/L的NaCl,0.1 mol/L的NaOH 各300 ml洗脫,流速為0.6 ml/min,每10 min收集1管。用苯酚-硫酸法在490 nm處測(cè)定吸光度值,繪制洗脫曲線,收集各洗脫峰組分,濃縮,透析,冷凍干燥。

2.2.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線制作 參照文獻(xiàn)[10]方法,精密稱定多糖標(biāo)準(zhǔn)品Dextran 2500,Dextran 4600,Dextran 7100,Dextran 10000,Dextran 21400,Dextran 41100,Dextran 84400,Dextran 133800,Dextran 270000分別置于10 ml容量瓶中,娃哈哈純凈水定容至刻度,配制成2 mg/ml的標(biāo)準(zhǔn)溶液。精密吸取20 μl進(jìn)樣,測(cè)得各標(biāo)準(zhǔn)品的保留時(shí)間。以保留時(shí)間為橫坐標(biāo),分子量的對(duì)數(shù)為縱坐標(biāo),繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。色譜柱:凝膠柱(TSK gel G4000PWXL(10)7.8*300);進(jìn)樣量20 μl;檢測(cè)器:示差檢測(cè)器,34 ℃;柱溫35 ℃;流速0.3 ml/min;流動(dòng)相:娃哈哈純凈水。

DEAE-纖維素52柱色譜分離后,共得到3個(gè)組分Asp-1,Asp-2和Asp-3,其中Asp-1和Asp-2兩組分含量較多。按照2.2.4所示的方法進(jìn)樣分析,以分子量為2 500,4 600,7 100,41 100,84 400,133 800等葡聚糖標(biāo)準(zhǔn)品得到的標(biāo)準(zhǔn)曲線,見(jiàn)圖2,標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為y=-0.234 42x+11.826,R2=0.999 26,線性關(guān)系良好(見(jiàn)圖2)。依次將Asp-1,Asp-2,Asp-3三個(gè)組分進(jìn)樣分析,實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)圖3。將保留時(shí)間代入標(biāo)準(zhǔn)曲線方程,通過(guò)計(jì)算得出水洗脫組分的分子量范圍為3 kD以下,NaCl洗脫組分的分子量范圍為為270 kD以上,NaOH洗脫組分的分子量范圍為3-10 kD。所以猜測(cè)黃芪花多糖分子量的主要分布范圍是3 kD以下及270 kD以上。

圖2 多糖分子量標(biāo)準(zhǔn)曲線圖 Figure 2 Standard curve of molecular weight of polysaccharides

Asp-1為蒸餾水洗脫組分;Asp-2為0.3 mol/L氯化鈉洗脫組分;Asp-3為0.1 mol/L氫氧化鈉洗脫組分圖3 DEAE-52纖維素柱洗脫曲線圖Figure 3 DEAE-52 cellulose column elution curve

2.3 黃芪花中多糖的單糖組成測(cè)定

2.3.1 氣相色譜-質(zhì)譜(GC-MS)條件 氣相條件:DB-5毛細(xì)管柱(30 m×0.5 mm×0.25 μm);載氣:高純氦;流速1.0 ml/min;分流比10 ∶1;進(jìn)樣口溫度220 ℃;程序升溫:起始溫度100 ℃,5 ℃/min升至180 ℃,保持1 min,1 ℃/min升至190 ℃,保持2 min,30 ℃/min升至220 ℃,保持2 min,1 ℃/min升至230 ℃,保持2 min,20 ℃/min升至280 ℃,保持10 min。

質(zhì)譜條件:Xcalibur 2.0.7工作站,電子轟擊(EI)離子源,離子源溫度220 ℃,傳輸線溫度250 ℃,掃描模式Full Scan;質(zhì)量掃描范圍m/z 45-550。

2.3.2 黃芪花多糖的酸水解 精密稱取黃芪花多糖粉末(Asp-1,Asp-2和Asp-3)5.00 mg分別置于10 ml具塞玻璃管中,加入500 μl,2 mol/L的TFA,120 ℃水解1.5 h,氮?dú)獯蹈?加甲醇復(fù)溶,氮?dú)獯蹈伞＜尤? ml 2% NaBH4-DMSO溶液,40 ℃搖床反應(yīng)90 min,加入乙酸調(diào)pH值至中性。再向溶液中加入200 μl的乙酸酐和50 μl的1-甲基咪唑,渦旋,反應(yīng)10-15 min,加入500 μl的蒸餾水終止反應(yīng),加入500 μl的二氯甲烷,渦旋,離心,取下層,重復(fù)萃取2次,合并有機(jī)相,吹干,備用。

2.3.3 標(biāo)準(zhǔn)品的衍生化 參照文獻(xiàn)衍生化方法[11],分別稱取8種單糖及對(duì)應(yīng)的糖醇標(biāo)準(zhǔn)品,溶于0.1 mg/ml的核糖醇-二甲亞砜溶液中。以1-甲基咪唑?yàn)榇呋瘎?乙酸酐為乙酰化試劑,衍生化反應(yīng)10 min。取蒸餾水終止反應(yīng),二氯甲烷萃取兩次,合并有機(jī)相,吹干后,復(fù)溶于二氯甲烷中,0.22 μm有機(jī)濾膜過(guò)濾,取1 μl濾液注入GC-MS,得到單糖及糖醇標(biāo)準(zhǔn)品的GC-MS色譜圖(見(jiàn)圖4)。以核糖醇為內(nèi)標(biāo)，加入含核糖醇 1%,10%,30%,50%,80%，根據(jù)下列公式分別求算核糖醇的標(biāo)準(zhǔn)曲線及各標(biāo)準(zhǔn)品與核糖醇的相對(duì)校正因子。標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算公式:lgms=algAs+b，相對(duì)校正因子計(jì)算公式:f=(ms/mi)·(Ai/As)，其中mi、ms分別表示待測(cè)糖和內(nèi)標(biāo)的質(zhì)量，Ai、As分別表示待測(cè)糖和內(nèi)標(biāo)的峰面積，f表示待測(cè)糖和內(nèi)標(biāo)的相對(duì)校正因子。單糖及其糖醇標(biāo)準(zhǔn)品測(cè)定結(jié)果見(jiàn)表4。

經(jīng)測(cè)定,DEAE-52纖維素柱洗脫得到的三個(gè)組分中,蒸餾水洗脫組分ASP-1中含有巖藻糖、葡萄糖、甘露糖。NaCl洗脫組分ASP-2中主要有木糖、鼠李糖、阿拉伯糖、甘露糖、半乳糖。NaOH洗脫組分ASP-3中主要有巖藻糖、阿拉伯糖、半乳糖、甘露糖、葡萄糖。

2.4 黃芪花中氨基酸成分測(cè)定

圖4 DEAE-52纖維素柱各洗脫組分單糖組成總離子流圖Figure 4 The monosaccharide composition of DEAE-52 cellulosic column elution component

2.4.1 氨基酸標(biāo)準(zhǔn)品的制備 參照文獻(xiàn)[12]方法略有改進(jìn),取20種氨基酸標(biāo)準(zhǔn)品,加蒸餾水配成濃度1 mg/ml的溶液,各取1 ml,分別加入400 μl的無(wú)水乙醇,100 μl的吡啶,50 μl的氯甲酸乙酯(ECF),20 ℃ 40 kHz超聲1 min,立即用500 μl正己烷萃取,渦旋,3 000 r/min離心,取上清。用7 mol/L的NaOH約100 μl調(diào)整pH 值為9-10,再加入50 μl的氯甲酸乙酯(ECF)進(jìn)行二次衍生化,超聲1 min,500 μl正己烷萃取,渦旋30 s,3 000 r/min離心10 min,取上清,合并上清,氮?dú)獯蹈伞Ｓ?00 μl氯仿復(fù)溶,混合所有標(biāo)準(zhǔn)品的衍生化產(chǎn)物,氮?dú)獯蹈伞?00 μl復(fù)溶,加入少量無(wú)水硫酸鈉,0.22 μm微孔濾膜濾過(guò),0.2 μl進(jìn)樣分析。

2.4.2 供試品溶液制備 黃芪花藥材粉碎后,稱取10 g黃芪花粗粉,加入70%乙醇溶劑300 ml,加熱回流提取,提取時(shí)間為3 h,料液比為1∶30。旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮后用蒸餾水定容于100 ml容量瓶。

2.4.3 黃芪花中氨基酸衍生化 取氨基酸樣品1 ml,參照標(biāo)準(zhǔn)品的衍生化方法進(jìn)行衍生化。

氣相條件:DB-5毛細(xì)管柱(30 m×0.5 mm×0.25 μm);載氣:高純氦;流速1.0 ml/min;分流比10 ∶1;進(jìn)樣口溫度220 ℃;程序升溫:起始溫度80 ℃,保持2 min。10 ℃/min升至140 ℃,保持1 min,4 ℃/min升至240 ℃,保持1 min,5 ℃/min升至280 ℃,保持5 min。

質(zhì)譜條件:同2.3.1中所述的質(zhì)譜條件。

表4 單糖及糖醇標(biāo)準(zhǔn)品的測(cè)定

Table 4 Detection of standard monosaccharides and alditols

編號(hào)名稱保留時(shí)間(min)回收率(%)RSD(%)檢出限(mol/L)校正因子f1木糖20．8694．241．342．5×10-80．522巖藻糖21．0295．491．787．6×10-90．743鼠李糖21．0891．113．459．1×10-80．684阿拉伯糖21．2097．780．971．1×10-70．845鼠李糖醇24．8294．111．284．6×10-80．346核糖醇24．9399．043．223．4×10-81．007巖藻糖醇25．3496．833．419．2×10-80．378阿拉伯糖醇25．5394．772．255．8×10-80．719木糖醇26．2192．161．664．2×10-81．0910果糖30．6095．962．691．7×10-70．5511半乳糖31．1496．212．236．3×10-81．0112甘露糖31．2598．353．716．6×10-80．8513葡萄糖31．5894．183．676．9×10-80．9514肌醇31．8896．164．285．6×10-90．8215甘露醇33．2396．601．435．5×10-90．8416山梨醇33．3295．512．191．2×10-80．7017半乳糖醇33．7396．891．451．9×10-80．72

RSD(relative standard deviation):相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差

按照2.4所示方法提取測(cè)定黃芪花中的氨基酸,其總離子流圖見(jiàn)圖5,各氨基酸含量見(jiàn)表5。

經(jīng)測(cè)定,黃芪花中含有17種氨基酸,其中有2種酸性氨基酸,3種堿性氨基酸,12種中性氨基酸。總氨基酸含量為6.016%。由氨基酸總離子流圖說(shuō)明此方法測(cè)定氨基酸能較好地分離各種氨基酸,并且雜質(zhì)峰較少。

圖5 黃芪花中氨基酸總離子流Figure 5 The total ion current of amino acids in Astragalus

表5 黃芪花中氨基酸含量 (n=3)

Table 5 Amino acids in flowers of Astragalus (n=3)

編號(hào)名稱英文名保留時(shí)間(min)質(zhì)量濃度(g/g)百分含量(%)1丙氨酸Ala10．210．01041．042甘氨酸Gly10．450．006950．6953纈氨酸Val13．020．003010．3014亮氨酸Leu14．850．002620．2625異亮氨酸Ile15．210．001780．1786蘇氨酸Thr15．460．002380．2387脯氨酸Pro15．930．006300．6308天冬酰胺Asn16．210．005400．5409天冬氨酸Asp19．560．002230．22310絲氨酸Ser21．460．002780．27811蛋氨酸Met21．72NDND12谷氨酸Glu22．810．004910．49113苯丙氨酸Phe24．80．001180．11814半胱氨酸Cys25．71NDND15谷氨酰胺Gln26．81NDND16賴氨酸Lys33．210．004120．41217組氨酸His34．40．001760．17618酪氨酸Tyr36．420．001230．12319精氨酸Arg38．010．001370．13720色氨酸Trp39．230．001740．17421總氨基酸-0．1136．016

ND(not detected): 樣本中未檢測(cè)到該氨基酸

3 討論

本文對(duì)黃芪花進(jìn)行了化學(xué)成分測(cè)定實(shí)驗(yàn),初步確定了其可能含有的化學(xué)成分。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,黃芪花中含有6種黃酮類成分、2種皂苷類成分、多種糖類成分以及17種氨基酸成分。與根部相比,黃芪花中芒柄花苷、異黃酮苷、毛蕊異黃酮等黃酮類成分含量較高,而毛蕊異黃酮苷、紫檀烷苷、芒柄花素等3種黃酮類成分及黃芪甲苷、黃芪皂苷Ⅱ兩種皂苷成分含量較低。黃芪花中共檢測(cè)到17種氨基酸,總氨基酸含量為6.016%,其中以丙氨酸含量最高,其次為甘氨酸、脯氨酸,除甲硫氨酸未測(cè)得外,人體必需氨基酸的含量為1.683%。黃芪與黃芪花中多糖組分均由葡萄糖、甘露糖、巖藻糖、木糖、鼠李糖、阿拉伯糖、半乳糖等單糖組成。通過(guò)閆巧娟等[13]測(cè)定黃芪多糖的分子量分布,我們發(fā)現(xiàn)黃芪多糖與黃芪花多糖分子量的分布范圍均主要在3 kD及270 kD以上。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,黃芪花具有極好的開(kāi)發(fā)利用前景,為進(jìn)一步研究開(kāi)發(fā)利用黃芪花資源提供了線索和依據(jù)。

大量臨床實(shí)踐與實(shí)驗(yàn)研究已證實(shí),黃芪在保健品、食品、化妝品中具有重要的藥理作用,并具有劑型多(口服液、沖劑、注射液)、用藥方便等優(yōu)點(diǎn)。隨著科學(xué)技術(shù)的進(jìn)步,對(duì)黃芪花的研究越來(lái)越廣泛,應(yīng)用領(lǐng)域也將不斷擴(kuò)大,這對(duì)于充分和對(duì)資源的可持續(xù)利用和開(kāi)發(fā)具有重要的指導(dǎo)意義。

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Qualitative and quantitative analysis of the main chemical components from flowers ofAstragalusmembranaceus

WANG Guizhen1,2, HAO Xia1,2, LIU Lei1,2,LI Zhenyu1, QIN Xuemei1, LI Ke1*

(1ModernResearchCenterforTraditionalChineseMedicine,ShanxiUniversity,Taiyuan030006,China;2CollegeofChemistryandChemicalEngineering,ShanxiUniversity;*Correspondingauthor,E-mail:like@sxu.edu.cn)

ObjectiveTo provide the basis for the full use of the medicinal plants by making qualitative and quantitative analysis of the main chemical components from flowers ofAstragalusmembranaceus.MethodsGC-MS was used to analyze the saccharides and amino acids in flowers ofAstragalusmembranaceus, and HPLC was used to analyze the flavonoids, saponins.ResultsAstragalusmembranaceusflowers contained 6 kinds of flavonoids ingredients, 2 kinds of saponins and sugars, and 17 kinds of amino acid.ConclusionAstragalusmembranaceusflowers contains a variety of chemical composition such as flavonoids, saponins,saccharides and amino acids, which will provide reference for the utilization ofAstragalusmembranaceusflowers.

Astragalus flower; chemical consistent; qualitative analysis; quantitative analysis

國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(31200278);教育部博士點(diǎn)新教師類基金資助項(xiàng)目(20131401120006)

王桂臻,女,1990-09生,在讀碩士,E-mail:1158319787@qq.com

2016-11-11

284.1

A

1007-6611(2017)02-0136-08

10.13753/j.issn.1007-6611.2017.02.010