E16.5 d胚胎小鼠皮膚細胞作為毛囊重建模型種子細胞的可行性研究

夏學穎， 何 偉， 孫 賽， 張碧芳， 李麗燕， 陳容容， 姜金豆， 胡葵葵

(1廣東省婦幼保健院醫學美容科，廣州 510010； 2順德區第一人民醫院燒傷整形科)

E16.5 d胚胎小鼠皮膚細胞作為毛囊重建模型種子細胞的可行性研究

夏學穎1， 何 偉2， 孫 賽1， 張碧芳1， 李麗燕1， 陳容容1， 姜金豆1， 胡葵葵1

(1廣東省婦幼保健院醫學美容科，廣州 510010；2順德區第一人民醫院燒傷整形科)

目的 研究胚胎小鼠皮膚及其毛囊的發育規律，探討胚胎小鼠的皮膚細胞作為毛囊重建模型種子細胞的可行性。 方法 對80只胎齡14.5-18.5 d小鼠及新出生的小鼠皮膚進行連續石蠟切片，連續切片進行HE染色，觀察其組織學結構并了解其附件形成情況。免疫熒光染色觀察胚胎表皮特異性蛋白細胞角蛋白8(cytokeratin 8，CK8)和18(CK18)在胚胎小鼠皮膚表達。 結果 胎齡14.5 d(embryonic day 14.5，E14.5 d)的胚胎小鼠，表皮層形成表皮細胞僅為 1-2層；E16.5 d的胎鼠背部皮膚較薄，表面凹凸不平并形成褶皺，未見毛囊形成；E18.5 d胎鼠毛囊發育達到旺盛的時期，毛囊數量明顯增加；新出生的小鼠皮膚附件基本發育成熟。E16.5 d小鼠皮膚中表皮干細胞標記物CK8和CK18為陽性。 結論 16.5 d胚胎小鼠(E16.5)的皮膚細胞可以作為毛囊重建模型的種子細胞。

種子細胞； 毛囊； 表皮干細胞； 細胞角蛋白； 胚胎小鼠

各種外界因素，如創傷、燒傷和慢性潰瘍，所導致的大面積皮膚損傷一直是臨床治療的難點。近年來，隨著老齡化人口的增加，慢性創面的發病率有上升趨勢[1]。組織工程皮膚作為一種新型組織移植物，有望為復雜難愈創面的治療提供新的治療策略[2]。種子細胞是構建組織工程人工皮膚的重要組成部分。表皮干細胞參與了毛囊的發生、修復、改建，并起著十分重要的作用[3,4]。毛囊的形成過程實質上是在胚胎發生期由多種因素誘導表皮干細胞定向分化為皮膚附件細胞的過程[5，6]。目前國內外研究表明，胎鼠真皮細胞或毛囊毛乳頭細胞中含有促進皮膚附件形成的信號[7]。本實驗通過HE染色觀察不同發育階段的胚胎小鼠皮膚的組織學結構，用兩種蛋白標記來觀察胚胎小鼠皮膚表皮干細胞情況，探討胚胎小鼠的皮膚細胞作為毛囊重建模型種子細胞的可行性。

1 材料和方法

1.1 實驗動物

C57BL/6J孕鼠，4-6周齡裸鼠(BALB/cAJcl-nu)均為上海市第九人民醫院動物中心提供，生產許可證：SCXK(滬)2013-0016。所有動物實驗均在動物保護和使用委員會的批準下進行的。交配之前小鼠采取小群飼養。在飼養的過程之中仔細注意觀察，選擇發情小鼠合籠飼養。合籠后，第2天觀察雌鼠是否有陰道栓的形成，觀察到陰道栓的當天為妊娠的0 d，取C57BL/6J E14.5 d，E16.5 d，E18.5 d胎鼠，P0天小鼠各20只進行實驗。

1.2 標本包埋

頸椎脫臼處死孕鼠，取出胎鼠，分離完整皮膚，在固定液中固定24 h。標本經固定、脫水、透明、浸蠟后包埋。切片脫蠟，然后依次放置于100%、95%、85%、75%的酒精中水化。連續切片進行HE染色。二甲苯Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ透明，中性樹脂封片，光鏡下觀察。

1.3 染色

石蠟切片脫蠟后，將組織切片置于盛滿EDTA抗原修復緩沖液(pH 9.0)的修復盒中于微波爐內進行抗原修復。切片稍甩干后用組化筆在組織周圍畫圈(防止抗體流走)，在圈內滴加用3%BSA均勻覆蓋組織，依次加入一抗和二抗，切片稍甩干后在圈內滴加DAPI染液，避光室溫孵育10 min。切片稍甩干后用抗熒光淬滅封片劑封片。切片于尼康倒置熒光顯微鏡下觀察并采集圖像。

2 結果

2.1 小鼠皮膚在不同階段的HE染色

E14.5 d的胚胎小鼠，表皮層形成表皮細胞僅為1-2層。E16.5 d的胎鼠背部皮膚較薄，表面凹凸不平并形成褶皺，未見毛囊形成。隨著胎鼠皮膚的發育皮膚褶皺逐漸減少，同時皮膚增厚，表皮層中開始出現局部的聚集并向皮膚的真皮層中凹陷。E18.5 d胎鼠毛囊發育達到旺盛的時期，毛囊數量明顯增加，發育中的毛囊逐漸伸長。新出生的小鼠皮膚明顯增厚，發育中的毛囊長度和密度均明顯增加，皮膚褶皺接近消失趨于平坦(見圖1)。

圖1 不同時間段胚胎小鼠皮膚及其附件的組織學觀察 (×100)Figure 1 Histological observation of fetal mouse skin structure at different development stages (×100)

2.2 E16.5 d小鼠皮膚的免疫熒光染色

對E16.5 d胚胎小鼠皮膚CK8、CK18的間接免疫熒光檢測結果顯示,早期表皮干細胞標記物CK8、CK18在表皮層陽性表達(見圖2)，提示在E16.5 d胚胎小鼠皮膚存在大量的表皮干細胞。

圖2 E16.5 d小鼠皮膚CK8/18免疫熒光染色 (×100)Figure 2 Expression of CK8/18 of the mouse embyonic skin at E16.5 d (×100)

3 討論

理想的組織工程皮膚的形態和功能應盡可能接近正常皮膚。目前臨床所用最好的組織工程皮膚并不具備正常皮膚的很多功能和附屬器結構[8]，缺乏皮膚的附屬結構如毛發、皮脂腺和汗腺將會喪失正常皮膚的生理功能(排泄和體溫調節等)。因此構建具有皮膚附屬結構的組織工程皮膚是亟待解決的重要問題，尤其是尋找合適的種子細胞是其關鍵。

有實驗表明，表皮干細胞在體外可以分化形成平滑肌細胞、神經元細胞、神經膠質細胞和色素細胞[9,10]。所以表皮干細胞非常適合成為體內毛囊重建的種子細胞。胚胎小鼠的表皮細胞和真皮細胞目前常被用于毛囊再生研究的。

了解胚胎小鼠皮膚早期發育，特別是皮膚附件的演變規律，可確定毛囊發育過程中分離和培養及鑒定表皮干細胞的最佳時間，為進一步在毛囊發育過程中尋找干細胞及毛囊發育分子機制的研究提供參考。本實驗觀察表明，在14.5 d的胚胎小鼠，表皮層形成表皮細胞僅為1-2層。16.5 d的胚胎小鼠是其皮膚附件發育的開始階段，還未見毛囊形成。隨著胎鼠皮膚的發育皮膚褶皺逐漸減少，同時皮膚增厚，表皮層中開始出現局部的聚集并向皮膚的真皮層中凹陷。18.5 d胚胎小鼠的皮膚附件發育是最為旺盛的時期，毛囊數量明顯增加，發育中的毛囊逐漸伸長。新出生的小鼠皮膚明顯增厚，發育中的毛囊長度和密度均明顯增加，皮膚褶皺接近消失趨于平坦。

根據以上實驗結果，結合目前國內外相關研究，本實驗初步的推斷，E16.5 d時是小鼠皮膚附件發育的開始階段，E18.5 d時小鼠皮膚附件發育最為旺盛的時期，新出生的小鼠的皮膚附件發育基本完成。對于目前表皮干細胞的鑒定尚無嚴格的統一的標準，比較常用的是CK8/18來進行鑒定。Bilousova等[11]實驗表明，CK8/18是外胚層向皮膚發育的早期標記物。因此CK8/18表達陽性的表皮干細胞被認為是多能性的表皮干細胞，在適當的微環境下能夠選擇分化為各種皮膚組織細胞。本實驗16.5 d胚胎小鼠皮膚中表皮干細胞標記物CK8/18為陽性，提示16.5 d的胚胎小鼠皮膚中含有大量的表皮干細胞，同時16.5 d胚胎小鼠的成纖維細胞有很強的誘導附件形成的能力。

綜上所述，16.5 d胚胎小鼠未見明顯附件形成。此時期小鼠的成纖維細胞有很強的誘導附件形成的能力。其次，16.5 d胚胎小鼠的表皮中，存在大量的表皮干細胞。

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Feasibility of follicle reconstitution with embryonic 16.5 d fetal mouse skin cells as seed cells

XIA Xueying1, HE Wei2, SUN Sai1, ZHANG Bifang1, LI Liyan1, CHEN Rongrong1, JIANG Jindou1, HU Kuikui1

(1DepartmentofMedicalCosmetology,GuangdongWomenandChildrenHospital,Guangzhou510010,China;2DepartmentofBurnandPlasticSurgery,FirstPeople’sHospitalofShunde)

ObjectiveTo investigate the periodical changes of hair follicles and explore the feasibility of constructing follicle reconstitution model with embryonic skin cells.MethodsThe skin structures of embryonic 14.5-18.5 d fetal mice and neonatal(P0)mice were observed by HE staining, and the expression of CK8/18 was observed in skin using immunofluorescence.ResultsOnly 1-2 layers of keratinocytes was seen in the E14.5 d fetal mouse. The hair follicles were not found in the E16.5 d fetal mouse. The skin became thicker gradually in the E18.5 d fetal mouse, and the skin appendage development basically completed. Skin appendages were mature in neonatal mice. The expression of CK8/18 was positive in the E16.5 d fetal mouse.ConclusionE16.5 d fetal mouse skin cells can be used as seed cells in follicle reconstitution.

seed cells; hair follicles; epidermal stem cells; CK8/18; fetal mice

廣東省自然科學基金資助項目(2014A030313675)；廣州市科技計劃基金資助項目(2014J4100139)

夏學穎，男，1981-03生,碩士，主治醫師，E-mail：xiaxueying212@sina.com

2016-11-15

R329.1

A

1007-6611(2017)02-0129-03

10.13753/j.issn.1007-6611.2017.02.008