人細胞角蛋白1基因的克隆、原核表達及純化

王 博， 侯衛坤， 周 艷， 蔡永松， 王林玉， 張 英， 韓 燕， 孟列素*

(1西安交通大學第一附屬醫院轉化醫學中心，西安 710061； 2西安交通大學醫學部基礎醫學院生物化學與分子生物學系； 3陜西省腫瘤精準醫學重點實驗室； 4西安交通大學醫學部附屬紅會醫院關節病醫院骨壞死與關節重建病區； 5西安交通大學第一附屬醫院皮膚科； 6西安交通大學第一附屬醫院消化內科； *通訊作者，E-mail：mengliesu@mail.xjtu.edu.cn)

人細胞角蛋白1基因的克隆、原核表達及純化

王 博1,2,3， 侯衛坤4， 周 艷5， 蔡永松2， 王林玉1，3， 張 英6， 韓 燕2， 孟列素2*

(1西安交通大學第一附屬醫院轉化醫學中心，西安 710061；2西安交通大學醫學部基礎醫學院生物化學與分子生物學系；3陜西省腫瘤精準醫學重點實驗室；4西安交通大學醫學部附屬紅會醫院關節病醫院骨壞死與關節重建病區；5西安交通大學第一附屬醫院皮膚科；6西安交通大學第一附屬醫院消化內科；*通訊作者，E-mail：mengliesu@mail.xjtu.edu.cn)

目的 克隆人細胞角蛋白1(cytokeratin 1,CK1)，原核表達系統表達融合蛋白并進行純化和鑒定。 方法 從人角質形成細胞系中提取RNA，以RT-PCR反轉錄cDNA，用特異性引物PCR擴增人CK1編碼區全長基因(NM_006121.3)，內切酶EcoRⅠ和Hind Ⅲ雙酶切PCR產物和pET-28a載體，T4 DNA連接酶將人CK1編碼區全長基因克隆到pET-28a載體上，IPTG誘導融合蛋白his-CK1的表達。融合蛋白經Ni2+親和層析純化，SDS-PAGE和Western blot鑒定。 結果 測序鑒定表明構建表達載體中人CK1序列正確；融合蛋白his-CK1的相對分子量為70 kD，并在大腸桿菌中高效表達；融合蛋白以包涵體形式，在變性條件下純化融合蛋白his-CK1，其純度大于90%；純化的融合蛋白his-CK1可與商品化CK1抗體以及His抗體特異性結合。 結論 成功構建了原核表達質粒pET-28a-CK1，并成功誘導表達及純化融合蛋白his-CK1。

細胞角蛋白1； 基因克隆； 融合蛋白； 原核表達系統

細胞角蛋白(cytokeratin,CK)屬于中間絲家族，是20世紀20年代由Franke等[1]在內皮細胞中首次發現。目前已知的細胞角蛋白家族由30個基因編碼，其中20個編碼上皮細胞相關基因，其余10個特異性編碼絲胞(trichocytes)基因[2]。CK主要分為兩型，Ⅰ型酸性細胞角蛋白，包括CK9、CK10、CK12、CK13、CK14、CK16、CK17、CK18、CK19和CK20，以及CK1、CK2、CK3、CK4、CK5、CK6、CK7和CK8，Ⅱ型堿性或是中性細胞角蛋白，兩型細胞角蛋白分子的二聚體形成細胞角蛋白鏈[3]。細胞角蛋白的種類和數目因細胞類型、細胞生長狀況和分化程度的不同而異，故CK表達具有組織器官的特異性，其中CK7特異性表達在泌尿生殖道的導管上皮細胞中，CK20常表達在胃腸道，CK19可作為非小細胞肺癌的血清學標志[4-6]。CK1主要是成人皮膚基底層以上部分的重要組成部分，該基因的突變可導致表皮松解性角化過度型魚鱗病等一系列皮膚疾病。所以，CK1的克隆與表達是深入研究CK1基因以及其蛋白結構的基礎，為進一步認識相關皮膚疾病提供較好前期幫助。

本研究從人角質形成細胞中提取RNA，以反轉錄的cDNA為模板特異性擴增人細胞角蛋白1的序列，并將該片段插入原核表達載體pET-28a，最終探討和優化了his-CK1融合蛋白的制備流程，為CK1的高效表達和純化提供思路，可進一步深入揭示上皮細胞中細胞角蛋白的功能，為其相關疾病的分子機制研究奠定基礎。

1 材料和方法

1.1 質粒、菌株和細胞系

原核表達質粒pET-28a(+)購自德國Novagen公司，該載體在其5′端含有His標簽，并在本實驗室西安交通大學醫學部基礎醫學院生物化學與分子生物學系保存。融合蛋白N端帶有6個His組成的標簽，能夠較好地運用鎳柱進行純化；宿主菌E.coliBL21( DE3)購自天根生化科技(北京)有限公司；人角質形成細胞株(HaCaT細胞)由西安交通大學第一附屬醫院轉化醫學中心保存，用含10% FBS高糖DMEM培養基，置于37 ℃、5% CO2培養箱中無菌培養。

1.2 主要試劑和工具酶

DNA凝膠回收試劑盒和質粒小量提取試劑盒購自天根生化科技(北京)有限公司；高糖DMEM培養基購自美國Hyclone公司；胎牛血清購自美國Gibco公司；TRIzol購自美國Invitrogen公司；cDNA反轉錄試劑盒RevertAidTMfirst strand cDNA synthesis kit購自美國Thermo Fisher公司；IPTG購自美國Amresco公司；Benzonase核酸酶購自德國Merck公司；親和層析柱(HisTrap)購自美國GE公司；兔抗人Cytokeratin 1多克隆抗體購自英國Abcam公司；HRP 標記羊抗兔IgG抗體購自北京博奧森生物技術有限公司；ECL試劑盒購自美國Pierce公司；相關引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成；高保真PCR酶TransStart FastPfu DNA Polymerase購自北京全式金生物技術有限公司；限制性內切酶EcoRⅠ和Hind Ⅲ、T4 DNA連接酶均購自寶生物工程(大連)有限公司。

1.3 目的基因CK1的PCR擴增

使用TRIzol試劑按照說明書要求提取HaCaT細胞總RNA，定量后取5 μg 總RNA，按照RevertAidTMfirst strand cDNA synthesis kit說明書反轉錄成cDNA。以該cDNA為模板，PCR擴增CK1基因編碼區序列全長。根據GenBank中Keratin 1(NM_006121.3)mRNA序列的CDs區域，用Oligo 7軟件設計克隆基因編碼區全長的特異性引物，并分別在上下游引物上引入EcoRⅠ和Hind Ⅲ酶切位點(下劃線標出)。上游引物：5′-CCGGAATTCATGAGTCGACAGTTTAGTTCCAG-3′；下游引物：5′-CCCAAGCTTTTATCTGGTTACTCCGGAATAAGTG-3′，產物長度1 953 bp。PCR反應體系：模板cDNA 1 μl，上游和下游引物(10 μmol/L)各1 μl，5×FastPfu Buffer 10 μl，2.5 mmol/L dNTPs 4 μl，FastPfu DNA Polymerase 1 μl，ddH2O補至50 μl；PCR反應條件：95 ℃ 3 min；95 ℃ 20 s，58 ℃ 20 s，72 ℃ 1 min，40個循環；72 ℃ 5 min。PCR產物經1%瓊脂糖凝膠電泳鑒定分析。

1.4 原核表達載體pET-28a-CK1的構建

將PCR產物用DNA凝膠回收試劑盒純化，用限制性內切酶EcoRⅠ和Hind Ⅲ雙酶切純化的PCR產物以及原核表達載體pET-28a(+)質粒。將酶切產物經0.8%瓊脂糖凝膠電泳分析，使用DNA凝膠回收試劑盒純化雙酶切的PCR和載體產物。按照目的基因與載體物質的量3∶1的比例用T4 DNA連接酶將CK1基因連接在原核表達載體pET-28a上。連接產物轉化E.coliBL21( DE3)感受態細菌，同時以對照質粒和無菌蒸餾水作為對照進行轉化，涂布在含有卡那霉素(Kan)的LB平板上，37 ℃倒置培養14-16 h。挑取單克隆菌落，接種在含Kan的LB培養液中，37 ℃振蕩培養過夜。使用質粒小量提取試劑盒提取篩選出的單克隆菌液中質粒DNA，經限制性內切酶EcoRⅠ和Hind Ⅲ雙酶切驗證陽性克隆。同時菌液作為模板進行菌液PCR鑒定，將鑒定的雙酶切產物和菌液PCR產物經0.8%瓊脂糖凝膠電泳，陽性克隆送生工生物工程(上海)股份有限公司進行測序鑒定。測序結果在線BLAST進行基因序列比對分析，比對序列與CK1序列完全相同的質粒命名為pET-28a-CK1。

1.5 融合蛋白his-CK1的誘導表達

將pET-28a-CK1對應的菌液按照1∶100轉接含Kan的LB培養液中，37 ℃振蕩培養至細菌達到對數生長期，即A600約為0.6時，將菌液分為5管加入ITPG進行誘導表達，使IPTG的終濃度分別為0.2，0.4，0.6，0.8，1.0 mmol/L，37 ℃振蕩培養3 h。取1 ml菌液，4 ℃ 5 000×g離心5 min，棄上清，加入50 μl 10 mmol/L Tris-HCl(pH 8.0)重懸沉淀，10%SDS-PAGE電泳以及考馬斯亮藍染色鑒定并選擇合理的誘導劑濃度；同上條件選取合適的IPTG濃度分別在IPTG誘導前、誘導后1，2，3，4，5，6 h取1 ml菌液，4 ℃ 5 000×g離心5 min，棄上清，加入50 μl 10 mmol/L Tris-HCl(pH 8.0)重懸沉淀，10% SDS-PAGE電泳以及考馬斯亮藍染色鑒定融合蛋白his-CK1是否表達，并選擇合理的誘導時間。

1.6 融合蛋白his-CK1的純化

將菌pET-28a-CK1 37 ℃振蕩培養過夜，按照1∶100轉接含Kan的LB培養液中，37 ℃振蕩培養至A600約為0.6時，加入IPTG至終濃度為0.4 mmol/L，37℃振蕩培養3 h，誘導融合蛋白his-CK1表達。將所有菌液4 ℃ 5 000×g離心5 min，棄上清，加入3倍體積的細胞裂解液[(100 mmol/L NaCl，1 mmol/L EDTA，50 mmol/L Tris-HCl(pH 8.0)]重懸菌體沉淀。冰上加入PMSF和溶菌酶混勻30 min，再加入Benzonase核酸酶振蕩混勻，室溫放置直至裂解液不再粘稠。4℃ 12 500×g離心15 min后棄上清，沉淀即為包涵體；包涵體用4 mol/L尿素細胞裂解緩沖液重懸，4 ℃放置2 h并間斷性渦旋促進溶解。4 ℃ 12 500×g離心15 min，棄上清，剩余包涵體用8 mol/L尿素結合緩沖液溶解，通過0.22 μm濾器過濾后上樣安裝在液相色譜系統(SHIMASDZU)的親和層析柱(HisTrap)，流速為1 ml/min，檢測波長為280 nm。上樣完后依次用35 mmol/L、50 mmol/L和100 mmol/L咪唑洗脫緩沖液作為流動相分步收集洗脫的目的蛋白his-CK1。將純化后的蛋白用10% SDS-PAGE電泳以及銀染鑒定融合蛋白his-CK1的純化程度。

1.7 純化his-CK1蛋白的鑒定

將純化的融合蛋白his-CK1進行10%SDS-PAGE電泳后，電轉移至NC膜上，5%脫脂牛奶室溫封閉2 h，加入一抗兔抗人Cytokeratin 1多克隆抗體(1∶2 000)，4℃孵育過夜。TBST洗膜3次，每次10 min，加入二抗HRP標記羊抗兔Ig G抗體(1∶10 000)，室溫孵育2 h，TBST洗膜2次，每次10 min，TBS洗膜10 min，ECL化學發光并照相。

2 結果

2.1 人CK1基因的克隆

HaCaT細胞提取總RNA，經RT-PCR轉錄成cDNA，以cDNA為模板PCR特異性擴增人CK1基因的編碼區。PCR反應產物經1%瓊脂糖凝膠電泳，見一條約2 000 bp的條帶，與目的基因的理論大小相一致(見圖1)。

M.DL2000 marker；1.人CK1基因的PCR擴增產物圖1 人CK1基因的PCR擴增 Figure 1 PCR amplification of human CK1 fragment

2.2 原核表達載體pET-28a-CK1質粒的構建及鑒定

將上述PCR擴增產物和質粒pET-28a進行雙酶切，連接，轉化BL21(DE3)感受態細菌，涂布于含Kan的LB平板上，37 ℃倒置培養過夜，挑取單克隆菌落進行鑒定。使用上述PCR克隆引物對菌液進行PCR鑒定，PCR反應產物經0.8%瓊脂糖凝膠電泳，見一條與目的基因的理論大小相一致的條帶(見圖2A)。再提取新構建的質粒，對重組質粒pET-28a-CK1進行EcoR Ⅰ和Hind Ⅲ雙酶切鑒定，0.8%瓊脂糖凝膠電泳結果顯示，約2 000 bp處的條帶為目的基因CK1，約5 300 bp處的條帶為載體pET-28a(見圖2B)。將構建成功的質粒pET-28a-CK1送公司測序，測序結果在NCBI中BLAST顯示克隆序列與人CK1的編碼區序列(NM_006121.3)完全一致，即本研究已成功構建原核表達載體pET-28a-CK1。

M.1 kb marker；1，2.構建的pET-28a-CK1載體單克隆菌落PCR產物；3，4.重組質粒pET-28a-CK1雙酶切鑒定結果 圖2 重組pET-28a-CK1質粒的菌落PCR和雙酶切鑒定Figure 2 Identification of recombinant plasmid pET-28a-CK1 by colony PCR and restriction enzyme digestion

2.3 不同濃度IPTG對融合蛋白his-CK1表達量的影響

使用不用濃度的IPTG(0.2，0.4，0.6，0.8，1 mmol/L)，37 ℃振蕩培養3 h，誘導融合蛋白his-CK1的表達發現，在誘導劑的濃度為0.4 mmol/L即可較好地誘導表達融合蛋白(見圖3)。

M.蛋白質marker；1.未加入IPTG；2-6.加 入0.2，0.4，0.6，0.8，1 mmol/L IPTG圖3 不同IPTG濃度誘導融合蛋白his-CK1表達的SDS-PAGE分析Figure 3 SDS-PAGE analysis of fusion protein his-CK1 after induced by different concentrations of IPTG

2.4 IPTG誘導融合蛋白his-CK1表達時間的確定

選擇上述0.4 mmol/L IPTG誘導劑在37 ℃條件下振蕩培養，分別誘導1，2，3，4，5，6 h，融合蛋白his-CK1的表達量在剛開始誘導1 h內大量表達，隨后隨時間的延長略有所增加，在誘導3 h后融合蛋白的表達量基本趨于穩定(見圖4)。

M.蛋白質marker；1.加入IPTG前；2-7.加入IPTG誘導1，2，3，4，5，6 h 圖4 不同IPTG誘導時間誘導融合蛋白his-CK1表達的SDS-PAGE分析Figure 4 SDS-PAGE analysis of fusion protein his-CK1 after induced by IPTG for different time

2.5 融合蛋白his-CK1的純化

由于融合蛋白his-CK1主要以包涵體形式存在，故his-CK1的純化在變性的條件下進行。將包涵體用8 mol/L尿素結合緩沖液溶解，經Ni2+親和層析柱富集，再依次用35 mmol/L、50 mmol/L和100 mmol/L咪唑洗脫緩沖液洗脫并分步收集融合蛋白his-CK1。分步收集的洗脫蛋白通過SDS-PAGE凝膠電泳和銀染分析，結果顯示50 mmol/L 咪唑洗脫緩沖液可以獲得純度和量最優的純化蛋白，且大小約為70 kDa，與融合蛋白的理論分子量相一致(見圖5)。

2.6 純化his-CK1蛋白的鑒定

將50 mmol/L咪唑洗脫緩沖液洗脫的融合蛋白和未加IPTG誘導的總蛋白，通過CK1和his抗體經Western blot分析鑒定結果證實，融合蛋白his-CK1的表達和純化(見圖6)。

3 討論

中間絲(intermediate filaments, IFs)廣泛分布在真核細胞中，直徑10 nm左右，介于肌動蛋白絲與肌球蛋白絲之間，其與肌動蛋白絲、微管都是細胞骨架的主要組成部分[7]。中間絲在細胞中分布主要圍繞細胞核，并延伸至細胞質膜與其相連結，是最為穩定的細胞骨架成分[8]。它們為細胞提供機械組織穩定性的同時，還參與細胞的囊泡運輸、細胞器定位、細胞周期調控、細胞分化和細胞活力等過程[9-11]。哺乳動物上皮細胞的細胞質中中間絲是由細胞角蛋白組成。

M.蛋白質marker；1.加入35 mmol/L咪唑洗脫緩沖液；2-8.加入50 mmol/L咪唑洗脫緩沖液；9-12.加入100 mmol/L咪唑洗脫緩沖液；13-14.加入層析柱洗脫緩沖液圖5 不同濃度咪唑純化融合蛋白his-CK1的銀染分析Figure 5 Fusion protein his-CK1 after treated with different concentrations of imidazole by silver stain analysis

1.未加IPTG誘導的總蛋白；2，3.加入50 mmol/L咪唑洗脫緩沖液洗脫的融合蛋白圖6 融合蛋白his-CK1的Western blot分析Figure 6 Western blot analysis of fusion protein his-CK1

細胞角蛋白的二級保守結構是所有中間絲所共有，其分子量大約為44-66 kD。由于細胞角蛋白具有較高的穩定性和耐化學型，是因為其在空間結構上具有一個高度保守的核心功能域，中間大約300-330個氨基酸殘基組成的α螺旋桿狀結構域以及N末端和C末端可變長度的非螺旋結構域[12]。N末端非螺旋結構域由V1和H1兩個亞基組成，C末端非螺旋結構域由V2和H2亞基組成，而核心α螺旋桿狀結構域由保守的L1、L12和L2連接序列將四個螺旋亞基1A、1B、2A和2B連接組成[13]。根據細胞角蛋白等電點的不同，將其分為Ⅰ型和Ⅱ型，通過Ⅰ型和Ⅱ型細胞角蛋白分子的等量連接形成絲狀結構的角蛋白[14]。故細胞角蛋白亞基可形成特異性的中間絲，中間絲的網絡又參與了大量的細胞功能過程，而且CK1又是Ⅱ型細胞角蛋白中最典型分子，因此CK1可以作為研究角蛋白結構和功能的重要分子。

大量的細胞實驗和轉基因動物研究表明，細胞角蛋白中間絲是保護上皮細胞抵抗不同機械和非機械壓力的重要必要條件[15-17]。細胞角蛋白可以將細胞核與細胞質膜在空間上聯系起來，從而在細胞核和細胞質膜之間傳遞信號[18]。而且多種人類疾病已證實細胞角蛋白的功能在維持上皮組織完整性中起到重要作用[19]。人類細胞角蛋白CK1通常與CK10配對，主要表達于基底層以上的各層中，并作為正常細胞終末分化的標志之一，同時角質形成細胞病變為主的皮膚病中都存在細胞角蛋白的異常表達[20]。CK1或者CK10基因的突變可導致角蛋白原發性魚鱗病(keratinopathic ichthyoses)，N末端或者C末端結構域錯義突變的雜合子可導致常染色體顯性表皮松解性魚鱗病(epidermolytic ichthyosis,EI)[21]。這些研究表明，CK1的表達與細胞的分化以及部分皮膚疾病的發生和發展密不可分，但其具體機制尚需進一步研究。

本研究通過從HaCaT細胞系的mRNA中特異性擴增人CK1編碼區全長基因并克隆到pET-28a載體上，轉入BL21感受態細胞后，選擇終濃度0.4 mmol/L IPTG以及誘導時間3 h誘導融合蛋白his-CK1的表達。融合蛋白經Ni2+親和層析純化后鑒定并檢測純度高于90%，說明本研究成功構建了原核表達質粒pET-28a-CK1，并建立融合蛋白his-CK1的誘導和純化方法。CK1的克隆與表達將有助于加深對CK1表達異常疾病的認識，同時也為深入研究上皮細胞中細胞角蛋白的功能和其相關疾病的具體分子機制奠定了基礎。

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Cloning, prokaryotic expression and purification of human cytokeratin 1

WANG Bo1,2,3, HOU Weikun4, ZHOU Yan5, CAI Yongsong2, WANG Linyu1,3,ZHANG Ying6, HAN Yan2, MENG Liesu2*

(1CenterforTranslationalMedicine,FirstAffiliatedHospitalofXi’anJiaotongUniversity,Xi’an710061,China;2DepartmentofBiochemistryandMolecularBiology,SchoolofBasicMedicalSciences,Xi’anJiaotongUniversityHealthScienceCenter;3KeyLaboratoryforTumorPrecisionMedicineofShaanxiProvince;4OsteonecrosisandJointReconstructionWard,JointSurgery,Xi’anHonghuiHospital,Xi’anJiaotongUniversityHealthScienceCenter;5DepartmentofDermatology,FirstAffiliatedHospitalofXi’anJiaotongUniversity;6DepartmentofGastroenterology,FirstAffiliatedHospitalofXi’anJiaotongUniversity;*Correspondingauthor,E-mail:mengliesu@mail.xjtu.edu.cn)

ObjectiveTo clone and fusion human cytokeratin 1 in prokaryotic expression system, and purify and identify the fusion protein.MethodsThe cDNA fragment of human cytokeratin 1(NM_006121.3) was amplified from keratinocyte total RNA with specific primers. The PCR products and vector pET-28a were digested with restriction endonucleaseEcoRⅠ andHind Ⅲ. The digested PCR products were cloned into vector pET-28a with T4 DNA ligase, and then the fusion protein of his-CK1 was induced by isopropy-β-D-thiogalactoside(IPTG).The expressed fusion protein of his-CK1 was purified by nickel ion affinity chromatography,and identified by SDS-PAGE and Western blot.ResultsThe sequencing proved that the recombinant vector of CK1 was correct. The molecular mass of his-CK1 fusion protein was 70 kD, and it was highly expressed inE.coli. The fusion protein was insoluble in inclusion body, and this his-CK1 was highly purified(purity>90%) under denaturing conditions. The his-CK1 showed specific binding to the commercialization antibodies of CK1 and His.ConclusionThe recombinant vector of pET-28a-CK1 has been successfully constructed, and the fusion protein of his-CK1 has been successfully expressed and purified.

cytokeratin 1; gene cloning; fusion protein; prokaryotic expression system

國家自然科學基金資助項目(81273211)；國家自然科學基金青年科學基金資助項目(81201373)；陜西省社會發展科技攻關項目(2016SF-238)；西安交通大學第一附屬醫院青年科學創新基金資助項目(2016QN-13)

王博，男，1987-12生，碩士，實習研究員，E-mail:realwbo@163.com

2016-11-30

Q785

A

1007-6611(2017)02-0114-06

10.13753/j.issn.1007-6611.2017.02.005