Klotho蛋白聯合紅花注射液對小鼠心肌損傷的保護作用

樊 蓉， 蘇顯明, 鄭二女

(1西安交通大學第一附屬醫院老年心血管內科，西安 710061；2西安141醫院老年病科； *通訊作者，E-mail:suxianming2011@163.com)

Klotho蛋白聯合紅花注射液對小鼠心肌損傷的保護作用

樊 蓉1,2， 蘇顯明1*, 鄭二女1

(1西安交通大學第一附屬醫院老年心血管內科，西安 710061；2西安141醫院老年病科；*通訊作者，E-mail:suxianming2011@163.com)

目的 分析Klotho蛋白聯合紅花注射液(H)對小鼠心肌損傷的保護作用。 方法 采用異丙腎上腺(ISO)制備小鼠心肌缺血損傷模型。將60只6-7周齡小鼠分成生理鹽水(NS)組、ISO組、Klotho(KL)組、丹紅(H)組及KL+H組。分別計算心臟質量指數(HW/BW)，測定血清乳酸脫氫酶(LDH)活性、丙二醛(MDA)含量、超氧化物歧化酶(SOD)活力、血清Klotho濃度，心肌組織石蠟包埋行HE染色、Massion染色、Caspase3染色。 結果 ISO實驗模型符合要求。與NS組比較，ISO組HW/BW、乳酸脫氫酶(LDH)活性、丙二醛(MDA)含量均顯著增加(P<0.01)，SOD活力顯著減低(P<0.01)。KL組、H組、KL+H組HW/BW%、LDH活性、MDA含量均顯著低于ISO組(P<0.01)，SOD活力、Klotho濃度顯著高于ISO組(P<0.01)。KL+H組HW/BW%、LDH活性顯著低于H組(P<0.01)，MDA含量顯著低于H組(P<0.05)，SOD活力顯著高于H組(P<0.01)，Klotho濃度顯著高于H組(P<0.05)。HE染色結果顯示：ISO組小鼠心肌細胞橫徑明顯大于NS組，伴隨著肌纖維紊亂和心肌間質成纖維細胞增生。治療組小鼠心肌細胞橫徑明顯小于ISO組；Masson染色結果顯示，ISO組小鼠心肌間質及血管壁有大量膠原纖維分布，而治療組小鼠的心肌間質及血管壁膠原纖維數量較ISO組明顯減少；Caspase 3染色結果顯示，各治療組棕黃色染色顆粒分布較ISO組明顯減少。染色陽性結果表現為胞質中有大量棕黃色染色顆粒分布。 結論 Klotho蛋白聯合紅花注射液可升高SOD活力，降低LDH活性、MDA含量和HW/BW%；兩者聯合可能通過抑制LDH活性和降低MDA水平、增加SOD活力和Klotho濃度對心肌損傷起到協同保護的作用。

Klotho蛋白； 紅花注射液； 心肌損傷； 異丙腎上腺素； 小鼠

缺血性心臟病(ischemia heart disease，IHD)是危害人類健康的主要疾病之一。目前用于防治心肌缺血損傷的藥物眾多。近年來一些天然物質保護心肌損傷的研究備受關注，這源于這些物質具備安全無毒的優點，副作用小的特性。紅花是心血管疾病研究領域極具開發前景的天然藥物。紅花注射液由菊科植物紅花提取制備，含較多黃酮類化合物，主要成分為紅花黃色素，從中醫角度講，紅花注射液具有活血化瘀、通經止痛的作用[1]，從西醫角度講紅花黃色素抑制二磷酸腺苷(ADP)誘導的血小板聚集作用，有防止血栓形成和發展或促進血栓溶解的作用，其能增加離體心臟冠狀動脈血流量，保護缺血心肌，降低心肌耗氧量，具有較強的抗心肌缺血作用和抗血小板聚集對抗自由基損傷作用[2,12]，降低氧化應激損傷指標[13]。已有研究資料表明，心肌損傷程度及概率與衰老因素有關[3，4]。Klotho基因是新近發現的獨立的抗衰老基因[5]，通過基因表達，產生膜結合受體和體液調節因子兩種蛋白物質。研究表明，Klotho基因具有的抗氧化應激、保護血管內皮細胞、影響細胞信號轉導通路[6]等作用均可針對心血管疾病的發病機制起到防治作用。本研究擬應用ISO誘導構建小鼠心肌損傷模型，通過計算心臟質量指數百分比(HW/BW%)，測定血清乳酸脫氫酶(LDH)活性、丙二醛(MDA)含量、超氧化物歧化酶(SOD)活力、血清Klotho濃度，心肌組織石蠟包埋行HE染色、Massion染色、Caspase 3染色的方法，觀察Klotho蛋白與紅花注射液聯合應用對心肌損傷的保護作用，為藥物聯合應用治療心肌損傷提供新的思路和參考。

1 材料與方法

1.1 主要試劑與儀器

異丙腎上腺素注射液(ISO)，上海天豐制藥廠，批號991011。鹽酸曲美他嗪(施維雅天津制藥有限公司，Batch 2008262)。Klotho蛋白；100 mg Cloud-Clone Corp，美國。Klotho蛋白試劑盒。總超氧化物歧化酶(SOD)測定試劑盒(WST-1法)，丙二醛(MDA)測定試劑盒(TBA法)，乳酸脫氫酶(LDH)試劑盒(微板法)；Caspase 3抗體；均由南京建成生物工程研究所提供。電子分析天平(Meilteler，GERMANY)。BX-60光學顯微鏡(Olympus，JAPAN)。低溫離心機(美國Eppendorf 5415R)。分光光度計(德國FLUOstar OPTIMA)。

1.2 實驗動物及分組

6-7周齡SPF近交系BALB/c小鼠60只，由西安交通大學醫學院實驗動物中心提供，生產許可證：SYXK(陜)2016-003。實驗動物隨機分為5組，每組12只。NS組：背部皮下注射0.9%氯化鈉10 ml/(kg·d)+腹腔注射0.9%氯化鈉10 ml/(kg·d)。ISO組：背部皮下注射ISO 5 mg/(kg·d)，腹腔注射0.9%氯化鈉注射液10 ml/(kg·d)。H組：ISO注射同ISO組，腹腔注射紅花注射液10 ml/(kg·d)。KL組：ISO注射同ISO組，腹腔注射Klotho蛋白0.01 mg/(kg·d)。KL+H組：ISO注射同ISO組，腹腔注射Klotho蛋白0.01 mg/(kg·d)+紅花注射液10 ml/(kg·d)。以上治療均從實驗第1天開始，1次/d,共9 d。

1.3 樣本采集與處理

實驗第10天稱重小鼠，4%水合氯醛麻醉小鼠，摘眼球采血，常規分離血清，-20 ℃保存，用于檢測血清乳酸脫氫酶(LDH)活性、丙二醛(MDA)含量、超氧化物歧化酶(SOD)活力、血清Klotho濃度。采血后，立即處死小鼠，快速取出心臟，剪去心臟周圍組織和血管，生理鹽水沖洗，用濾紙吸干殘余液體，稱全心重(heart weight,HW)，計算心臟質量指數(HW/BW)。4%多聚甲醛固定心臟，常規石蠟切片(4 μm)。分別用HE染色觀察心肌的形態改變，Masson染色觀察膠原容積含量變化，Caspase 3染色檢測細胞凋亡。

1.4 血清Klotho蛋白濃度的測定

血清KLotho蛋白采用酶聯免疫吸附試劑盒測定，在450 nm波長下于酶標儀中測定樣本吸光度，據標準品吸光度及濃度繪制標準曲線，根據標準曲線計算出各樣本濃度。

1.5 血清乳酸脫氫酶(LDH)活性、丙二醛(MDA)含量、超氧化物歧化酶(SOD)活力的測定

按試劑盒操作說明測定血清LDH、MDA、SOD活力值。

1.6 統計學分析

2 結果

2.1 動物模型的建立

本研究采用經典的ISO誘導小鼠急性心肌損傷實驗模型。為評估實驗模型的有效性，實驗中引入HW/BW、乳酸脫氫酶(LDH)活性、丙二醛(MDA)含量、超氧化物歧化酶(SOD)活力的檢測指標，并設立對照組，ISO模型組與NS對照組均行HE染色、Masson染色。與NS組比較，ISO組HW/BW、乳酸脫氫酶(LDH)活性、丙二醛(MDA)含量均顯著增加(P<0.01)，SOD活力顯著減低(P<0.01，見表1)。HE染色結果發現持續的皮下注射ISO(9 d)可引起心肌細胞的肥大以及肌纖維排列的紊亂(見圖1)；Masson染色發現ISO 可顯著增加心肌間質及血管壁周圍的膠原蛋白含量，引起心肌間質纖維化(見圖2)。說明實驗模型建立成功。

2.2 各組HW/BW%、SOD活力、LDH活性、MDA含量及Klotho濃度變化

KL組、H組、聯合組HW/BW、LDH活性、MDA含量顯著低于ISO組，SOD活力及Klotho濃度顯著高于ISO組，組間比較差異有統計學意義(P<0.01，見表2)。

表1 兩組HW/BW、SOD活力、LDH活性、MDA含量比較

Table 1 Comparison of HW/BW,SOD activity,LDH activity,MDA content between the two groups

組別HW/BWSOD活力(U/ml)LDH活性(U/L)MDA含量(nmol/ml)NS組0．42±0．0220．86±5．807009．90±2427．184．51±2．87ISO組0．50±0．02??14．43±2．02??15834．98±2372．68??11．52±7．27??

與對照組比較，*P<0.05，**P<0.01

圖1 HE染色兩組心肌結構比較 (×400)Figure 1 HE dyeing of cardiac structures in two groups (×400)

圖2 Masson染色兩組心肌結構改變 (×400)Figure 2 Masson staining of cardiac structures in two groups (×400)

表2 各組HW/BW、SOD活力、LDH活性、MDA含量、Klotho濃度比較

Table 2 Comparison of HW/BW,SOD activity,LDH activity,MDA content between four groups

組別HW/BWSOD活力(U/ml)LDH活性(U/L)MDA含量(nmol/ml)Klotho濃度(pg/ml)ISO組0．50±0．0214．43±2．0215834．98±2372．6811．52±7．72174．19±180．42KL組0．45±0．01??25．20±5．69??10036．30±1616．01??4．66±2．73??384．93±208．25??H組0．47±0．02??20．46±3．52??8033．00±2072．10??6．35±1．83??276．41±114．15??KL+H組0．44±0．04??##25．90±4．31??##9336．63±1236．66??##3．59±2．99??#413．52±123．58??#

與ISO組比較，*P<0.05,**P<0.01；與H組比較#P<0.05,##P<0.01

2.3 Klotho蛋白和紅花單用及聯合對心肌組織HE染色及Masson染色的影響

HE染色結果顯示：ISO組小鼠心肌細胞橫徑明顯大于各治療組，伴隨著肌纖維紊亂和心肌間質成纖維細胞增生；Masson染色結果顯示，ISO組小鼠心肌間質及血管壁有大量膠原纖維分布，而治療組小鼠的心肌間質及血管壁膠原纖維數量較ISO組明顯減少(見圖3)。

2.4 Klotho蛋白和紅花單用及聯合對Caspase 3染色的影響

Caspase 3染色結果顯示：各治療組棕黃色染色顆粒分布較ISO組明顯減少。染色陽性結果表現為胞質中有大量棕黃色染色顆粒分布(見圖4)。

3 討論

圖4 各組對心肌組織Caspase 3染色 (×400)Figure 4 Caspase 3 dyeing of myocardial tissue (×400)

心肌缺血是指心臟的血液灌注減少，導致心臟的供氧減少，心肌能量代謝不正常，不能支持心臟正常工作的一種病理狀態。通過注射ISO誘發小鼠急性心肌缺血損傷模型是研究抗心肌缺血藥物的經典模型[7]。

機體急性心肌缺血造成的心肌組織損傷使心肌細胞、內皮細胞中的LDH 泄漏到血液中，因此心肌酶LDH被認為是心肌細胞受損程度的重要標志酶[8]。本研究結果顯示，心肌損傷小鼠給予Klotho蛋白及紅花注射液能顯著地降低血清中LDH活力，說明Klotho蛋白及紅花注射液能改善缺血心肌組織受損程度。MDA系自由基的脂質過氧化產物具備很強的生物毒性，可引起組織結構功能損傷，測定血清MDA的水平可反映自由基對生物膜過氧化損傷的嚴重程度[9,10]。SOD是能夠清除氧自由基的酶，對機體的氧化和抗氧化平衡起著至關重要的作用，測定 SOD的高低可間接反應機體氧化損傷的程度和清除氧自由基的能力[11]。實驗結果提示：心肌損傷小鼠給予Klotho蛋白及紅花注射液能使SOD 活力上升，并且顯著地降低了血清MDA 含量，這說明Klotho蛋白及紅花注射液能改善急性心肌缺血小鼠心肌組織的氧化損傷。

心肌缺血最終造成心肌組織損傷通過病理切片可以直觀地觀察到組織損傷的程度。HE染色結果表明，重組 Klotho 蛋白、紅花注射液單用及合用均可抑制ISO誘導的小鼠心臟組織的病理變化。NS組心肌纖維走形正常；而ISO注射之后小鼠心臟組織的 HE 染色表現為心肌纖維走形紊亂、間質成纖維細胞顯著增生，表現為細胞核密度的增加以及單核細胞局限性浸潤，提示ISO 組中嚴重的心肌損傷；而治療組可以改善上述改變。Masson染色結果表明，心肌間質及血管周的膠原纖維含量明顯高于對照組，而治療組可抑制膠原纖維的增加。Caspase 3染色結果表明ISO注射后，心肌細胞的凋亡顯著增加，而治療組可改善ISO誘導的小鼠心肌細胞的凋亡。研究表明Klotho蛋白及紅花注射液單用、合用均能改善急性心肌缺血造成的病理性損傷。

綜上所述，Klotho蛋白聯合紅花注射液主要通過對抗氧自由基、拮抗心肌過氧化損傷來發揮對ISO致小鼠心肌缺血損傷的保護作用。

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Protective effect of Klotho protein combined with safflower injection on myocardial injury in mice

FAN Rong1，2, SU Xianming1*, ZHENG Ernü1

(1DepartmentofGeriatricCardiology,FirstAffiliatedHospitalofXi’anJiaotongUniversity,Xi’an710061,China；2141thHospitalofXi’an:*Correspondingauthor,E-mail:suxianming2011@163.com)

ObjectiveTo explore the protective effect of Klotho protein combined with safflower injection on isoproterenol-induced myocardial injury in mice.MethodsThe myocardial ischemia injury model was induced by injecting isoproterenol(ISO) in mice. Sixty 6-7-week-old mice were randomly divided into five groups as follow: 0.9% sodium chloride solution(NS)group, ISO group, Klotho(KL) group, safflower(H)group and KL+H group. The cardiac index(HW/BW%) was calculated, serum lactate dehydrogenase(LDH) activity was measured by enzyme standard method, the level of malondialdehyde(MDA) was detected by thiobarbituric acid method(TBA), superoxide dismutase(SOD) activity was determined by WST-1 method, and the concentration of serum Klotho was measured by ELSIA.The cardiac muscular tissue was imbedded with paraffin and stained with HE, Massion and Caspase 3, respectively.ResultsCompared with NS group, HW/BW%,LDH activity,MDA level were significantly increased in ISO group(P<0.01), and SOD activity was significantly decreased(P<0.01). HW/BW%, LDH activity and MDA level in KL group, H group and in KL+H group were significantly lower than in ISO group(P<0.01), while concentrations of SOD and Klotho were significantly higher(P<0.01). HW/BW, LDH activity in KL+H group were significantly lower than in H group(P<0.01), MDA level was also significantly lower(P<0.05), while SOD activity was significantly higher than in H group(P<0.01), and the concentration of Klotho was also significantly higher(P<0.05).HE staining results showed that the myocardial cell diameter in ISO group was bigger than in NS group, accompanied by disordered muscle fibers and hyperplastic myocardial interstitial fibroblasts. The cardiomyocytes diameters in treatment groups were much smaller than in ISO group. Masson staining results showed that there was a lot of collagen fiber distribution in the myocardial interstitial and hemal walls in ISO group, but they were significantly decreased in treatment groups. Caspase 3 dyeing results showed that the tan dyeing numbers in treatment group were significantly less than in ISO group. Staining positive results were large brownish yellow dye in kytoplasm.ConclusionKlotho protein combined with safflower injection may protect from myocardial injury by inhibiting LDH activity and decreasing MDA level, increasing SOD activity and concentration of Klotho.

Klotho protein; safflower injection; myocardial injury; isoproterenol; mice

陜西省自然科學基金資助項目(2016JM8082)

樊蓉，女，1987-04生，在讀碩士，住院醫師，E-mail：284111962@qq.com

2016-10-28

R362

A

1007-6611(2017)02-0101-05

10.13753/j.issn.1007-6611.2017.02.002